Vacunas de células T autólogas contra la esclerosis múltiple.

Procedimiento para la preparación de una vacuna de células T autólogas para el tratamiento de la esclerosis múltiple,

comprendiendo el procedimiento:

(a) la estimulación primaria in vitro de células T de un paciente a tratar con la vacuna con una combinación de fragmentos de uno o más antígenos asociados con la esclerosis múltiple,

(b) estimular las células T obtenidas en la etapa (a) con células presentadoras de antígenos (APC) y la combinación de fragmentos, y

(c) repetir la etapa (b) una o más veces;

en el que el antígeno asociado a la esclerosis múltiple se selecciona del grupo que consiste en proteína básica de mielina, proteína de proteolípido y glicoproteína de oligodendrocitos de mielina.

Vacunas de células T autólogas contra la esclerosis múltiple

Antecedentes de la invención [0001] Existe una evidencia creciente que sugiere que las respuestas de células T autoinmunes a antígenos de mielina, incluyendo la proteína básica de mielina (MBP) , están implicadas en la patogénesis de esclerosis múltiple (MS) (Stinissen et al., Crit. Rev. Immunol. 1997; 17: 33-75) . Se observa que las células T reactivas a MBP experimentan una activación in vivo y aparecen a una frecuencia de precursor elevada en la sangre y el fluido cerebroespinal de pacientes con MS (Zhang et al., J. Exp. Med., 1994; 179: 973-984; Chou et al., J. Neuroimmunol., 1992; 38: 105-114; Allegretta et al., Science, 1990; 247: 718-721) . Estas células T reactivas a MBP producen citoquinas Th1 proinflamatorias (IL-2, TNF-a e interferón-y) y se cree que facilitan la inflamación destructora de mielina en el sistema nervioso central (Sharief et al., N. Engl. J. Med., 1991; 325: 467-472; Selmaj et al., J. Clin. Invest., 1991; 87: 949-954) . Se ha observado que las células T reactivas a MBP pueden inducir la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) , un modelo animal para MS (Ben-Nun et al., Eur. J. Immunol., 1981; 11: 195-204) . EAE también se puede prevenir o curar mediante inoculaciones repetidas con células T reactivas a MBP que han sido inactivadas mediante tratamiento químico o radiación, un procedimiento de tratamiento denominado vacunación de células T (Ben-Nun et al., Nature, 1981; 292: 60-61) . Se ha demostrado que la vacunación de células T induce a respuestas inmunes reguladoras comprendidas de células T anti-idiotípicas y células T anti-ergotípicas, que contribuyen a los efectos del tratamiento sobre EAE y otros modelos de enfermedades autoinmunes experimentales (Lider et al., Science, 1988; 239: 820-822; Lohse et al., Science, 1989; 244: 820-822) .

La vacunación de células T ha avanzado recientemente a pruebas clínicas en pacientes con MS en base a la hipótesis que el agotamiento de células T reactivas a MBP puede mejorar la evolución clínica de la enfermedad. En una prueba clínica piloto, se demostró que la vacunación con clones de células T reactivas a MBP autólogas irradiadas produjo respuestas de células T citolíticas CD8+ que reconocían específicamente y lisaban células T reactivas a MBP utilizadas para la vacunación (Zhang et al., Science, 1993; 261: 1451-1454, Medear et al., Lancet 1995: 346; 807-808) . Tres inoculaciones subcutáneas con clones de células T reactivas a MBP irradiadas dieron lugar al agotamiento de las células T reactivas a MBP circulantes en pacientes con MS. El agotamiento de células T reactivas a MBP mediante la vacunación de células T parecía estar correlacionada con una mejora clínica, tal como se pone de manifiesto mediante la reducción en la tasa de reincidencia, la escala expandida del estado de discapacidad (EDSS) y actividades de lesiones por MRI en pacientes con reincidencia-remisión (Medaer et al., 1995) . Aunque no se podían sacar conclusiones a partir de la prueba piloto debido al número limitado de pacientes con MS estudiados, el excelente perfil de seguridad y el potencial beneficio clínico animó a realizar más investigaciones clínicas. Esta prueba clínica preliminar se llevó a cabo para investigar si el agotamiento de células T reactivas a MBP circulantes serian beneficiosas clínicamente para pacientes con MS.

Descripción resumida de la invención [0003] La presente invención está dirigida a procedimientos para producir vacunas de células T autólogas y a la utilización de una vacuna de células T autólogas en la fabricación de un medicamento, tal como se indica en las reivindicaciones.

También se describe en este documento una vacuna de células T autólogas.

En particular, se describe una vacuna de células T autólogas preparada mediante un procedimiento denominado el procedimiento de expansión directa (DEM) que proporciona un procedimiento más rápido, sencillo y rentable para preparar una vacuna de células T. El procedimiento de expansión directa es el procedimiento preferido para la producción de vacunas cuando las células T, que han sido identificadas por ser reactivas con la proteína de mielina o fragmentos de la misma, tienen un índice de estimulación (S.I.) de 5 o superior. El procedimiento de expansión directa comprende la obtención a partir de un paciente con MS a tratar de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o células mononucleares del fluido cerebroespinal de un paciente (CSFMCs) . A continuación, las PBMCs o CSFMCs obtenidas del paciente se incuban en presencia de un antígeno asociado a la esclerosis múltiple, tal como la proteína básica de mielina (MBP) o uno o más fragmentos inmunogénicos de MBP. Otros antígenos asociados con la esclerosis múltiple útiles en la realización de la presente invención incluyen lipoproteína de proteolípido de mielina, glicoproteína de oligodendrocitos de mielina y glatirámer, y fragmentos de los mismos. En un ejemplo más preferido, el fragmento inmunogénico o fragmentos de MBP son fragmentos inmunodominantes. Los fragmentos de MBP más preferidos incluyen un fragmento que corresponde a los aminoácidos 83-99 de MBP y un fragmento que corresponde a los aminoácidos 151-170 de MBP. Las células también se pueden incubar sin considerar los antígenos y/o fragmentos de los mismos relacionados con la esclerosis múltiple. Después de la incubación con MBP o fragmentos de la misma, las PBMCs o CSFMCs se incuban de nuevo a continuación con MBP y/o fragmento de la misma en presencia de células presentadoras de antígeno (APCs) . Las células presentadoras de antígeno preferidas para su uso en la realización de la presente invención incluyen PBMCs irradiadas obtenidas del paciente. Las células tratadas de este modo se someten a continuación a ciclos de estimulación alternativos con un mitógeno, preferiblemente fitohemaglutinina e IL-2. Entre otras moléculas mitogénicas útiles en el proceso de la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, concanavalina A y mitógeno de la hierba carmín. Otras moléculas mitogénicas útiles en la realización de la presente invención incluyen anticuerpos para receptores de la superficie de células T, tales como un anticuerpo monoclonal para CD3. Los ciclos de estimulación alternativa se pueden repetir una o más veces.

También se describen procedimientos para tratar MS utilizando vacunas de células T autólogas. Dichos procedimientos no se reivindican en el presente documento. El procedimiento comprende la administración a un paciente con necesidad de la misma, de una dosis eficaz de una vacuna de células T autólogas. Las dosis preferidas comprenden desde aproximadamente 40 x 106 a aproximadamente 80 x 106 células. La vacuna se puede administrar mediante cualquiera de una serie de vías de administración incluyendo, pero sin limitarse a, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. La inyección subcutánea es la vía de administración preferida de la vacuna. Una dosis eficaz es la dosis necesaria para dar lugar a un descenso en el número o frecuencia de precursor de células T reactivas a mielina en la circulación del paciente. Otros indicios de eficacia incluyen alteraciones en la causa clínica de la enfermedad medida mediante criterios ampliamente conocidos que incluyen un descenso en EDSS o mediante la prevención del aumento en EDSS o mediante el retraso en la progresión de EDSS. Otros indicios de eficacia incluyen la reducción en la velocidad de exacerbación clínica o una estabilización o una reducción en el tamaño de las lesiones cerebrales según se detecta mediante MRI u otras metodologías de diagnóstico.

De manera análoga también se describen procedimientos para tratar la artritis reumatoide utilizando las vacunas de células T preparadas tal como se describe en el presente documento.

Otra realización de la presente invención proporciona un procedimiento para producir una vacuna de células

T autólogas mediante el “procedimiento de clonación”. Éste es preferible cuando las células T que han sido identificadas por ser reactivas con uno o más fragmentos de la proteína de mielina, tienen un índice de estimulación por debajo de 5.

El procedimiento de clonación comprende la identificación de líneas de células T reactivas a MBP o lipoproteína de proteolípido de mielina, glicoproteína de oligodendrocitos de mielina, glatirámer y/o fragmentos de cualquiera de los anteriores tal como se describe en este documento. Las líneas de células T que tienen un S.I. inferior a 5 se clonan mediante dilución limitante. El procedimiento comprende la obtención de células T reactivas con MBP y/o fragmentos de la misma... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de una vacuna de células T autólogas para el tratamiento de la esclerosis múltiple, comprendiendo el procedimiento:

(a) la estimulación primaria in vitro de células T de un paciente a tratar con la vacuna con una combinación de fragmentos de uno o más antígenos asociados con la esclerosis múltiple,

(b) estimular las células T obtenidas en la etapa (a) con células presentadoras de antígenos (APC) y la combinación de fragmentos, y

(c) repetir la etapa (b) una o más veces;

en el que el antígeno asociado a la esclerosis múltiple se selecciona del grupo que consiste en proteína básica de mielina, proteína de proteolípido y glicoproteína de oligodendrocitos de mielina.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que las células T derivan de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que se añade IL-2 a las células T en una o más de las etapas (a) , (b) y (c) .

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que las APC son células mononucleares de sangre periférica irradiadas del paciente.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que uno o más de los fragmentos es un fragmento inmunogénico de proteína básica de mielina.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además como última etapa la etapa de irradiar las células T.

7. Utilización de una vacuna de células T autólogas en la fabricación de un medicamento para tratar la esclerosis múltiple en un paciente, que comprende la preparación de una vacuna de células T autólogas según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que el medicamento contiene una dosis eficaz de dicha vacuna de células T suficiente para reducir el número de células T reactivas a mielina en la circulación del paciente.

Figura 1