Uso de la cadena de espectrina cerebral y fragmentos de la misma para diagnosticar enfermedades cerebrales.

Un procedimiento in vitro para pronosticar y/o diagnosticar malaria cerebral,

caracterizado porque comprende una etapa de medir el nivel de anticuerpos dirigidos contra las partes central y/o del extremo C-terminal de la cadena α de espectrina no eritroide, que se extiende respectivamente del aminoácido 1139 al aminoácido 1498 y del aminoácido 1499 al aminoácido 2472 de dicha proteína, en una muestra biológica.

Uso de la cadena de espectrina cerebral y fragmentos de la misma para diagnosticar enfermedades cerebrales.

La presente invención se refiere a los campos de las enfermedades cerebrales y del control de la malaria. Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento para realizar un pronóstico y/o diagnóstico in vitro de malaria cerebral, con el fin de proporcionar rápidamente un tratamiento apropiado a un paciente en necesidad del mismo.

La malaria sigue siendo una de las principales causas de muerte en la mayoría del África subsahariana, y las tasas de mortalidad son particularmente altas para niños por debajo de la edad de cinco años, mujeres embarazadas e individuos inmunodeficientes (1) . El desenlace mortal se produce casi exclusivamente en pacientes infectados con Plasmodium falciparum que progresa a malaria grave (1, 2) . La anemia grave y la malaria cerebral (MC) son los tipos más prevalentes de malaria por P. falciparum grave, y la MC muestra el espectro clínico más agudo. Los pacientes que desarrollan MC presente con un intervalo de manifestación neurológica aguda y la patología se caracterizan por una encefalopatía difusa, alteración en niveles de consciencia, coma profundo y convulsión precedente a muerte (2, 3) . Shukla y col. enseñan que cambios en los niveles de espectrina a no eritroide de longitud completa y la presencia de fragmentos proteolíticos de espectrina en muestras de tejido de cerebro son características patológicas de la malaria cerebral (44) . Sin embargo, actualmente, los eventos patológicos que conducen a malaria mortal en seres humanos no están bien caracterizados. Entender los mecanismos implicados es un reto importante, ya que será crucial para el desarrollo de nuevas terapias y/o vacunas preventivas o curativas, y podría conducir a marcadores de pronóstico de definición.

En el estado de la técnica se han desvelado marcadores para lesiones neurales. Por ejemplo, los documentos WO 2004/025298 y WO 2002/046767 desvelan biomarcadores y procedimientos para el diagnóstico y la evaluación de la gravedad de lesiones neurales y/o trastornos neuronales. Entre los biomarcadores están fragmentos proteolíticos de espectrina a-II y 1-II. El documento WO 2004/025298 enseña que la espectrina a-II y sus fragmentos proteolíticos son marcadores de diagnóstico y/o de pronóstico de lesión de células nerviosas en trastornos neurológicos tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson e isquemia hemorrágica. El documento JP 07198717 desvela el uso diagnóstico de anticuerpos policlonales y monoclonales, que reconocen un fragmento de polipéptido de la cadena a de una espectrina no eritroide. Day y col. (1999) desvelan péptidos proteolíticos correspondientes a fragmentos de la cadena a de espectrina no eritroide como marcadores bioquímicos adecuados de enfermedad de Alzheimer (45) . Vazquez y col. (1996) enseñan que los productos de degradación de la espectrina son útiles como marcadores de neurodegeneración (46) .

En MC, el secuestro de glóbulos rojos maduros infectados por P. falciparum al endotelio cerebral es claramente un evento central en la patogénesis. Uno de los factores que se cree que influye en el desenlace clínico es el fino balance entre las citocinas pro- y antiinflamatorias producidas durante la infección y que modulan respuestas inmunitarias inducidas por parásitos (4, 5) . Las citocinas pro-inflamatorias, tales como interferón y (IFNy) y factor de necrosis tumoral a (TNFa) , son conocidas por desempeñar una función importante en la fisiopatología de la MC. El documento US 2005/260697 desvela TNFa y otras citocinas pro/antiinflamatorias como marcadores de pronóstico de malaria cerebral. Las citocinas pro-inflamatorias inducen cambios en las células endoteliales cerebrales que conducen a la expresión superficial de moléculas de adhesión, tales como ICAM-1, CD36 y proteína relacionada con trombospondina, y adhesión a parásito (6, 7) . Sin embargo, también se ha informado que IFNy y TNFa protegen contra malaria (8-10) . La participación de citocinas antiinflamatorias en la malaria sigue siendo una materia de debate y varios estudios en seres humanos han informado de asociaciones entre altas concentraciones de IL-10 y tanto malaria grave como protección (5, 11-14) .

Se ha mostrado recientemente que la producción de autoanticuerpos para los canales de calcio regulados por voltaje del cerebro, pero no otros canales de ion calcio, aumentaron con la gravedad de la infección por P. falciparum en niños keniatas (15) . Los anticuerpos para las proteínas del sistema nervioso central se han asociado a convulsión y epilepsias en varias enfermedades autoinmunitarias y se cree que desempeñan una función en la patología (16) . La hipergammaglobulinemia y la activación de linfocitos B policlonales comúnmente se producen en infecciones por Plasmodium sp. (17-19) . Algunos de los anticuerpos producidos reconocen auto-componentes de diversos tejidos y órganos, tales como eritrocitos, linfocitos, estructuras de ácido nucleico, citoesqueleto, músculo liso, corazón y tiroides (20-28) . Cada vez existen más pruebas de que altos niveles de anticuerpos contra fosfolípido (PL) , cardiolipina (CL) , ADNmc, ADNbc y factor reumatoide se correlacionan con la gravedad de la enfermedad en pacientes infectados por P. falciparum (22, 25, 29-31) y la prueba de antiglobulina de Coombs es positiva en individuos infectados por P. falciparum que padecen anemia grave (32-35) . No está claro si los anticuerpos autoreactivos desempeñan o no una función en inmunidad protectora contra parásitos en el estado de sangre (36-38) . Además, no se sabe si la presencia de estos autoanticuerpos es o no una consecuencia de la infección o si contribuye o no a los eventos que conducen a malaria grave, que incluyen el desarrollo de complicaciones neurológicas ligadas a malaria cerebral por P. falciparum. Además, sigue sin estar claro si IFNy, TNFa y IL-10 regulan o no la respuesta auto-reactiva de anticuerpos durante la malaria. La respuesta auto-reactiva de anticuerpos en cirrosis biliar primaria (39) está regulada por las tres citocinas mencionadas anteriormente.

En ese contexto, los inventores han investigado varios parámetros, entre los cuales la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra tejidos de cerebro en malaria por P. falciparum, con el fin de identificar marcadores relevantes para diagnosticar malaria cerebral. Para este fin, y como se describe en detalle en la parte experimental más adelante, reclutaron tres grupos de pacientes que asistían al Hospital pediátrico Owendo y al Centro hospitalario de Libreville en Gabón según su estado clínico en el momento del ingreso: malaria no complicada (MNC) , malaria no cerebral grave (MNCG) o malaria cerebral (MC) . Usando sueros recogidos de estos pacientes, se combinaron un procedimiento de inmunotransferencia cuantitativa (transferencia PANAMA) que facilitaba la comparación de miles de antígenos simultáneamente (40, 41) con análisis multifactorial para comparar el repertorio de reactividades de IgG con antígenos de cerebro humano desarrollados en los sueros de controles y grupos de pacientes infectados por P. falciparum. Investigaron adicionalmente si niveles de TNFa, IFNy y IL-10 circulantes en estos grupos de pacientes se asociaron o no al repertorio de reactividades de IgG y fenotipo de enfermedad.

Los inventores han demostrado la presencia de alto nivel de autoanticuerpos ampliamente dirigidos contra la cadena a de espectrina no eritroide (también llamada fodrina) en malaria por P. falciparum. Los resultados desvelados en la parte experimental más adelante muestran que hay una relación entre el nivel de autoanticuerpos y los síntomas clínicos, y que los anticuerpos auto-reactivos están asociados al desarrollo de malaria cerebral, especialmente cuando se asocian a alta concentración de TNFa circulante. Más específicamente, los inventores han demostrado que los anticuerpos auto-reactivos presentes a un alto nivel en pacientes con malaria cerebral están predominantemente dirigidos contra las partes central y/o del extremo C-terminal de la cadena a de espectrina no eritroide. En lo que sigue, la “parte central la cadena a de espectrina no eritroide” se define como la parte de la proteína que se extiende desde aproximadamente el aminoácido 1139 al aminoácido 1498, y la “parte del extremo C-terminal de la cadena a de espectrina no eritroide” engloba los residuos 1499 a 2472 de la proteína.

Además, la espectrina no eritroide se libera en el líquido cefalorraquídeo de pacientes que padecen lesión cerebral grave, tal como malaria cerebral.

Por tanto, la presente invención se refiere al uso de anticuerpos específicos para la cadena a de espectrina no eritroide,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para pronosticar y/o diagnosticar malaria cerebral, caracterizado porque comprende una etapa de medir el nivel de anticuerpos dirigidos contra las partes central y/o del extremo Cterminal de la cadena a de espectrina no eritroide, que se extiende respectivamente del aminoácido 1139 al aminoácido 1498 y del aminoácido 1499 al aminoácido 2472 de dicha proteína, en una muestra biológica.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es una muestra de sangre o plasma.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que se mide el nivel de inmunoglobulinas G (IgG) dirigidas contra las partes central y/o del extremo C-terminal de la cadena a de espectrina no eritroide.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una etapa de medir la concentración de TNFa en una muestra biológica.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la IgG dirigida contra las partes central y/o del extremo C-terminal de la cadena a de espectrina no eritroide se detectan y/o cuantifican por un inmunoensayo.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que varias moléculas antigénicas derivadas de la cadena a de espectrina no eritroide se usan como moléculas de captura en dicho inmunoensayo.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que al menos una de dichas moléculas antigénicas está seleccionada del grupo que consiste en los polipéptidos de SEQ ID Nos: 14 a 29 y SEQ ID No: 45.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho inmunoensayo es un ensayo de inmunocaptura, en el que un anticuerpo dirigido contra inmunoglobulina humana se usa como molécula de captura, y una espectrina no eritroide marcada o fragmento de la misma se usa para la detección de los anticuerpos dirigidos contra las partes central y/o del extremo C-terminal de la cadena a de espectrina no eritroide.

9. Un kit para establecer un pronóstico y/o un diagnóstico de malaria cerebral, caracterizado porque comprende al menos una molécula antigénica seleccionada del grupo que consiste en los polipéptidos de SEQ ID No: 45 y SEQ ID Nos: 14 a 29.