Uso de dispositivos y métodos para detectar líquido amniótico en secreciones vaginales.

Método para detectar la pérdida de líquido amniótico en secreciones vaginales,

comprendiendo el método detectar la unión de un par de anticuerpos específicos para la alfa-1 microglobulina placentaria (PAMG-1) en una secreción vaginal.

Uso de dispositivos y métodos para detectar líquido amniótico en secreciones vaginales

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico para detectar con precisión pequeñas cantidades de líquido amniótico en la vagina. En particular, la invención se refiere al uso de anticuerpos monoclonales específicamente seleccionados que se unen específicamente a la 1-microglobulina placentaria. Más específicamente, la presente invención se refiere a la selección de un par de anticuerpos (“par básico”) que proporciona sensibilidad suficiente para la detección de la concentración de fondo mínima del PAMG-1 en la secreción vaginal de una mujer en estado de gestación. Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso de un sistema de inmunoensayo en fase sólida que comprende anticuerpos contra PAMG-1, en los que se inmoviliza una combinación de dos o más anticuerpos anti-PAMG-1 en el soporte en fase sólida del dispositivo para establecer con precisión un umbral predefinido de nivel de sensibilidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La rotura prematura de la membrana fetal (saco amniótico) se produce aproximadamente en el 10% de las mujeres en estado de gestación y cuando no se trata rápidamente, es la causa de aproximadamente el 10% de todas las muertes perinatales. El término PROM (rotura prematura de las membranas fetales) se refiere a la rotura espontánea de las membranas a las 24 horas o más después del comienzo del parto ya sea a término o a pretérmino. La PPROM se refiere a la rotura prematura de las membranas a pretérmino. Aproximadamente alrededor del 30- 50% de dichas roturas prematuras se producen antes de la semana 37 de la gestación. En dichos casos, el diagnóstico definitivo de la rotura es extremadamente importante ya que la PROM se asocia con un aumento significativo de riesgo de una infección intrauterina y alteración del desarrollo del sistema pulmonar del feto. La introducción intrauterina de dichas infecciones aumenta tanto la morbilidad maternal como la perinatal y la mortalidad en aproximadamente el diez por ciento. La diagnosis inmediata de una rotura a las 38 a 40 semanas de gestación es crucial, ya que una vez que se detecta la PROM debe inducirse el parto tan pronto como sea posible. La diagnosis de la rotura también es importante antes de las 37 semanas de gestación porque permite la prevención de infecciones intra-amnióticas y la estimulación del desarrollo pulmonar del feto.

No existe un “patrón de oro” disponible para el diagnóstico de la rotura de la membrana. La PROM es una entidad dinámica, de manera que el intervalo entre la rotura de la membrana y la implementación de la modalidad de diagnóstico, la presencia de “elevadas” pérdidas, pérdida intermitente, variaciones en la incidencia de PROM en relación con poblaciones y la consideración de material que tiene la capacidad de interferir con los resultados del ensayo son factores que cuando no se tratan dan como resultado una información incorrecta. Estas incorrecciones pueden conducir a errores de interpretación en estudios que se dirigen a descubrir la mejor herramienta para la identificación de la PROM.

El diagnóstico de la PROM se ha basado tradicionalmente en la información del paciente de la descarga de líquido desde la vagina. El examen físico es capaz de realizar diagnósticos inequívocamente; sin embargo, hay veces en las que los hallazgos del examen son inconsistentes o erróneos internamente. Esta situación exige la necesidad de ensayos de diagnóstico de confirmación (Lockwood C. J. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 1994, v. 171, Nº 1, pp. 146150) . Hasta ahora se han usado diversos métodos, todos ellos insuficientes, para detectar líquido amniótico en la vagina, tales como el ensayo del helecho (M. L. Friedman y T.W. McElin, “Diagnosis of Ruptured Fetal Membranes”,

American Journal of Obstetrics and Gynecology 1969, Vol. 100, pp. 544-550) . Este método se basa en la detección de líquido amniótico por la observación de la denominada arborización cuando el líquido amniótico se seca en un portaobjetos. Este método, sin embargo, no es suficientemente preciso ya que se basa en las propiedades sumamente volátiles del líquido amniótico en la vagina. Esto puede producir falsos resultados en más del 30 por ciento de los casos.

También se ha propuesto detectar la rotura de la membrana fetal empleando diversos colorantes: azul Nilo, naranja de acridina, azul de bromotimol, nitracina, etc. (M. L. Friedman y T.W. McElin, anteriormente) . Esta estrategia no es conveniente y tiene desventajas con respecto a la volatilidad de las propiedades químicas del líquido amniótico en la vagina y algunas posibles mezclas del mismo. Por ejemplo, una infección vaginal puede afectar a los resultados de los ensayos anteriores. Un estudio previo de los ensayos actualmente habituales de Nitrazina y Helecho indicaron que estos ensayos tenían elevadas tasas de imprecisión, que aumentaban progresivamente cuando había transcurrido más de una hora desde la rotura de la membrana y se hizo incierto después de 24 horas. El estudio concluye que en casos de PROM prolongada estos ensayos no proporcionan mejor información de diagnóstico que la obtenida por simple evaluación clínica (Gorodeski I.G., Haimovitz L., Bahari C.M., Journal Perinat. Med., 1982, v. 10, Nº 6, págs. 286-292) . Los datos más recientes (Trovo S. et al., Minerva Ginecol. 1998, v. 50, Nº 12, págs. 519512) de los ensayos son:

Los ensayos de Nitrazina muestran una sensibilidad del 70%, una especificidad del 97% y una precisión del 90%; Los ensayos Helecho muestran una sensibilidad del 70% y una precisión del 93%.

Se ha propuesto recientemente detectar la rotura de las membranas fetales basándose en un análisis inmunoquímico de las proteínas en el líquido amniótico. Los análisis inmunoquímicos incorporados utilizan las siguientes proteínas del líquido amniótico para detectar una rotura de membrana: alfa-fetoproteína, prolactina,

fibronectina y el factor del crecimiento de tipo insulina unido a proteína 1, véase B.L. Rochelson et al., “Rapid Assay

– Possible Application in the Diagnosis of Premature Rupture of the Membrames” en Obstetrics and Gynecology, 1983, v. 62, pp. 414-418; P.R. Koninckx et al., “Prolactin Concentration in Vaginal Fluid: a New Method for Diagnosing Ruptured Membrames”, British J. Obstetr. Gynecol., 1981, v. 88, pp. 607-610; P. Hellemans, et al., “Preliminar y Results with the Use of the ROM Check Immunoassay in the Early Detection of Rupture of the Amniotic Membranes”, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 1992, v. 43 (3) , pp. 173-179; Rutanen, E.M., et. al., “Measurement of Insulin-like Growth-Factor binding Protein-1 in Cervical/Vaginal Secretions: Comparison with the ROM Check Membrame Immunoassay in the Diagnosis of Ruptured Fetal Membranes”, Clin. Chim. Acta., 1993, v. 214, pp. 73-81. Rutanen, E.M., et al. desarrollaron posteriormente un ensayo cromatográfico usando la membrana cromatográfica colocada al revés (FI-84863; Patente de Estados Unidos Nº 5.554.504) .

Los métodos que se basan en la detección de alfa-fetoproteína (AFP) y prolactina (PRL) no son fiables ya que la proporción sangre/líquido amniótico de las proteínas AFP y PRL es propensa a variaciones significativas. La AFP y la PRL están presentes en el líquido amniótico a elevadas concentraciones tan solo durante el segundo trimestre de gestación. En ambas proteínas la proporción de la concentración de proteína en líquido amniótico/suero es tan solo aproximadamente de 3 a 4 a término.

Otro método basado en la detección de fibronectina fetal en las secreciones vaginales también se ha observado que no es satisfactorio. Por ejemplo, la presencia de fibronectina fetal puede tener lugar incluso en ausencia de la rotura de membrana fetal (P. Hellemans, et al., “Preliminar y Results with the Use of the ROM Check Immunoassay in the Early Detection of Rupture of the Amniotic Membranes”, Eur. J. Obstetr. Gynecol. Reprod. Biol. 1992, v. 43 (3) , pp. 173-179; C. Lockwood, et al., “Fetal Fibronectin in Cervical and Vaginal Secretions as a Predictor of Preterm Deliver y ”, New England Journal of Medicine, 1991, v. 325, pp. 669-674) , produciendo por lo tanto resultados positivos falsos.

Todos estos métodos de detección de la rotura de la membrana fetal, basados en la detección de alfaproteína, prolactina y fibronectina son imprecisos debido a factores variables en el control de la concentración de estas proteínas en el líquido amniótico y a la concentración relativa de estas proteínas en el líquido amniótico... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar la pérdida de líquido amniótico en secreciones vaginales, comprendiendo el método detectar la unión de un par de anticuerpos específicos para la alfa-1 microglobulina placentaria (PAMG-1) en una secreción vaginal.

2. El método de la reivindicación 1, en el que

el par de anticuerpos es sensible a un nivel de PAMG-1 por encima de un ruido de fondo; y/o donde uno del par de anticuerpos se inmoviliza en un soporte sólido.

3. El método de la reivindicación 2, en el que

el soporte sólido es una membrana a través de la cual puede pasar el líquido por acción capilar; y/o los anticuerpos son anticuerpos monoclonales; y/o comprende adicionalmente un segundo anticuerpo específico para PAMG-1 inmovilizado en el soporte sólido.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la proporción de anticuerpos inmovilizados en el soporte sólido proporciona un nivel umbral de detección de PAMG-1 de 5 nanogramos por mililitro.

5. El método de la reivindicación 3, en el que un anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en M271, producido por el hibridoma N271, depositado en la Institución Depositaria de la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM) y con número de acceso asignado VKPM-93; M52, producido por el hibridoma N52, depositado en la VKPM y con número de acceso asignado VKPM-92; y M42, producido por el hibridoma N42, depositado en la VKPM y con el número de acceso asignado VKPM-94.

6. El método de la reivindicación 1, comprendiendo el método:

(i) seleccionar un par de anticuerpos monoclonales altamente específicos para la determinación de la concentración mínima de ruido de fondo de PAMG-1 en una secreción vaginal; y

(ii) seleccionar otros anticuerpos monoclonales anti-PAMG-1 para ser usados en combinación con el par en un dispositivo de ensayo en tira con el fin de determinar de manera precisa un umbral prescrito de sensibilidad del dispositivo de ensayo en tira.

7. El método de la reivindicación 6, en el que

el anticuerpo monoclonal altamente específico del par de anticuerpos monoclonales (i) se localiza en una región almohadilla del dispositivo en tira; y/o en donde el anticuerpo monoclonal altamente específico se une a un marcador.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el marcador es una partícula de colorante.

9. El método de la reivindicación 6, en el que

el segundo anticuerpo monoclonal del par (i) se localiza en una región de prueba del dispositivo en tira; y/o en el que uno o más de los otros anticuerpos monoclonales anti-PAMG-1 adicionales (ii) se localizan en una región de ensayo de dicho dispositivo en tira en una proporción predefinida respecto al segundo anticuerpo (i) del par.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dichos anticuerpos (ii) usados en combinación con dicho par se utilizan para establecer un umbral predefinido de sensibilidad en dicho dispositivo en tira.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6, 9, y 10, en el que dichos anticuerpos monoclonales anti-PAMG-1 (i) y (ii) se usan en combinación en una proporción predefinida para establecer el intervalo óptimo entre el valor del nivel de fondo de dicho PAMG-1 en la secreción vaginal, en el rango de 0.05 a 0.2 nanogramos por mililitro, y el umbral de sensibilidad de dicho dispositivo en tira, dicho umbral estando en el rango de 5 a 10 nanogramos por mililitro, con el fin de minimizar la probabilidad de resultados falsos positivos y falsos negativos en la detección de cantidades pequeñas de líquido amniótico en la secreción vaginal de mujeres embarazadas.

12. Uso de un dispositivo que comprende un anticuerpo inmovilizado específico para PAMG-1 y un anticuerpo movible específico para PAMG-1 para detectar la pérdida de líquido amniótico en secreciones vaginales, en el que la movilización del anticuerpo movible por una muestra de líquido permite la unión del anticuerpo movible a cualquier PAMG-1 de la muestra y la unión del complejo PAMG-1-anticuerpo movible formado de esta manera, al anticuerpo inmovilizado, en donde el anticuerpo movible comprende un marcador.

13. El uso de la reivindicación 12, en el que

los anticuerpos son anticuerpos monoclonales, y/o el anticuerpo inmovilizado se inmoviliza en un soporte membrana; y/o el marcador es oro coloidal; y/o además comprende un segundo anticuerpo específico para PAMG-1 inmovilizado en el soporte sólido; y/o la proporción de los anticuerpos inmovilizados en el soporte sólido proporciona un nivel umbral de detección de pAMG-1 de 5 nanogramos por mililitro.

14. El uso de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en M271, producido por el hibridoma N271, depositado en la Institución Depositaria de la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM) y con el número de acceso asignado VKPM-93; M52, producido por el hibridoma N52, depositado en el VKPM y con el número de acceso asignado VKPM-92; y M42, producido por el

hibridoma N42, depositado en el VKPM y con el número de acceso asignado VKPM-94.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

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