Un reactivo para lisar parcialmente una membrana celular de un glóbulo rojo, un reactivo para detectar glóbulos rojos infectados de malaria, y un método para analizar muestras para detectar glóbulos rojos infectados de malaria.

Un reactivo para lisar parcialmente una membrana celular de un glóbulo rojo infectado con un parásito de lamalaria,

de tal manera que un parásito de la malaria es retenido en el glóbulo rojo parcialmente lisado y pasacolorante fluorescente a través de la membrana celular parcialmente lisada, que comprende:un primer tensioactivo catiónico y

un segundo tensioactivo catiónico que es diferente del primer tensioactivo catiónico;

en donde el reactivo tiene un pH de 5 a 7 y una presión osmótica de 200 a 300 mOsm/kg·H2O.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06006120.

Solicitante: SYSMEX CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 5-1, Wakinohama-Kaigandori 1-chome, Chuo-ku Kobe-shi Hyogo 651-0073 JAPON.

Inventor/es: YOSHIDA,AYUMU, UCHIHASHI,KINYA, ITOSE,YUJI, KONISHI,AYA, IIZUKA,HIROMITSU.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N33/569 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
  • G01N33/80 G01N 33/00 […] › en los que intervienen grupos o tipos sanguíneos.

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Fragmento de la descripción:

Un reactivo para lisar parcialmente una membrana celular de un glóbulo rojo, un reactivo para detectar glóbulos rojos infectados de malaria, y un método para analizar muestras para detectar glóbulos rojos infectados de malaria

Campo de la invención La presente invención se refiere un reactivo para lisar parcialmente una membrana celular de un glóbulo rojo, un reactivo para detectar glóbulos rojos infectados de malaria, y un método para analizar muestras para detectar glóbulos rojos infectados de malaria.

Antecedentes La malaria es una infección parasitaria de amplia distribución en la zona subtropical. Su agente patógeno es un parásito de la malaria clasificado como apicomplexa y es transmitida por un mosquito anofeles.

La malaria se clasifica en 4 tipos, es decir, la malaria tropical, la malaria terciana, la malaria cuartana y la malaria ovale, entre las que la malaria tropical es particularmente maligna, y salvo que se inicie su terapia dentro de unas pocas horas después de la aparición, la malaria tropical está acompañada de síntomas graves y complicaciones, dando como resultado con frecuencia la muerte. Las otras malarias, por otro lado, no son tan graves y rara vez conducen a la muerte.

Por lo tanto, la malaria tropical y las otras malarias son considerablemente diferentes con respecto al método de tratamiento y el medicamento que tiene que ser utilizado. Los síntomas de la malaria tropical empeoran rápidamente, lo que hace necesario un tratamiento inmediato, y desde el punto del salvamento de un paciente, hay casos en que la administración del medicamento se inicia cuando se sospecha que el paciente tiene la malaria tropical antes de que se haya establecido el diagnóstico final. Por consiguiente, existe la posibilidad de un diagnóstico erróneo y del efecto secundario de la medicina administrada. Otras malarias no requieren tal tratamiento inmediato y por lo tanto pueden ser tratadas consumiendo mucho tiempo.

En la fase de diagnóstico clínico, por lo tanto, es muy importante discriminar la malaria tropical a partir de las otras malarias y determinar de ese modo rápidamente con precisión un método terapéutico adecuado. En consecuencia, es importante el diagnóstico precoz de la malaria, particularmente de la malaria tropical.

En el tratamiento de la malaria tropical, el tipo de medicamento que se administra, la cantidad de medicamento que se administra y la duración de la administración son juzgados empíricamente y determinados por un médico, sobre la base de la razón de infección (razón del número de glóbulos rojos infectados de malaria con respecto al número de glóbulos rojos totales contenidos en la sangre de un volumen predeterminado) . Considerando el tratamiento de la malaria tropical, por lo tanto, es necesario discriminar la malaria tropical de las otras malarias, y también es importante conocer la razón de la infección de malaria en la sangre del paciente.

Como método convencional que se utiliza en la detección de la malaria, existe un método que comprende preparar un frotis de sangre recogida de un objeto predeterminado, someterlo a tinción de Giemsa y observarlo a microscopio para detectar glóbulos rojos infectados de malaria, o un método que comprende contar los glóbulos rojos y glóbulos rojos infectados en un campo visual específico y calcular la razón de infección.

Sin embargo, el método por observación bajo microscopio es problemático debido a la necesidad de las etapas de preparación, fijación, tinción y secado de un frotis. Adicionalmente, son necesarios conocimientos prácticos sofisticados para discriminar glóbulos rojos infectados de malaria de glóbulos rojos no infectados de malaria y juzgar si el tipo de la malaria con el que se infectaron las células es la malaria tropical u otra malaria. Además, es necesario mucho tiempo (normalmente 15 minutos o más para un paciente) para la observación bajo un microscopio.

Como método para detectar automáticamente los glóbulos rojos infectados de malaria, también se desarrolla un método que implica la tinción de los glóbulos rojos infectados de malaria con un colorante fluorescente y la detección de los glóbulos rojos infectados de la malaria con un citómetro de flujo.

Sin embargo, cuando se utiliza un colorante fluorescente de ácido nucleico como se describe en la técnica anterior mencionada en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.470.751, existe el problema de que no sólo los glóbulos rojos infectados de malaria, sino también los reticulocitos se tiñen, de modo que los dos tipos de células no pueden ser discriminados unos de otros. Se propone tinción sólo de glóbulos rojos infectados de malaria con un colorante fluorescente específico (análogo de Auramina O) a baja concentración en la Patente de los Estados Unidos Núm.

5.470.751 supra. En este método, sin embargo, la discriminación de los glóbulos rojos infectados de malaria de los glóbulos rojos infectados no se hace suficientemente evidente.

Por otro lado, Vianen P. H. et al. (P. H. Vianen et al., Cytometr y , 14:276-280) describen un método que comprende la lisis de glóbulos rojos con un agente de lisis que contiene un agente tamponador, formaldehído y dietilenglicol, para liberar parásitos de la malaria de glóbulos rojos infectadas de malaria, la tinción de los parásitos de la malaria con un colorante Hoechst 33258, y la detección de los parásitos con un citómetro de flujo. En este método, la influencia de glóbulos rojos no infectados de malaria y de los reticulocitos es insignificante, pero existe el problema de que la lisis y los procedimientos de tinción son engorrosos por requerir decenas de minutos o más.

El documento EP 1406088 describe un método para detectar un parásito de la malaria mediante el tratamiento de glóbulos rojos infectados con un primer agente hemolítico que tiene un primer tensioactivo seguido de tratamiento con un segundo agente hemolítico que tiene un segundo tensioactivo. El segundo tensioactivo tiene una actividad hemolítica más alta que el primer tensioactivo. El parásito de la malaria se libera de las células y se detecta.

El documento JP-A 11-75892 describe un método que comprende la liberación de parásitos de la malaria por hemólisis, la tinción rápida de los parásitos de la malaria específicamente con un colorante que tiñe ácido nucleico y, sin separación centrífuga, la detección de los mismos con un citómetro de flujo. Sin embargo, la discriminación entre la malaria tropical y las otras malarias se lleva a cabo generalmente mediante la observación de la forma de los parásitos de la malaria en los glóbulos rojos infectados de malaria, por lo que el método del documento JP-A 1175892 supra en donde los glóbulos rojos se lisan puede evaluar si las células están infectadas con malaria o no, pero no puede determinar si la malaria es la malaria tropical o no.

JP-A 2004-105027 propone un método para evaluar el tipo de parásito de la malaria con un citómetro de flujo mediante la utilización de una diferencia en la cantidad de un colorante de unión a ácido nucleico entre la malaria tropical y las otras malarias. Este método es un método que comprende la lisis de glóbulos rojos en una muestra para liberar parásitos de la malaria, la detección de la intensidad de fluorescencia de los parásitos de la malaria en la muestra de medición, y la evaluación del tipo de los parásitos de la malaria sobre la base de la distribución de frecuencias de parásitos de la malaria que tiene una intensidad de fluorescencia en un intervalo predeterminado.

Sin embargo, el método de detección de parásitos de la malaria liberados por lisis de glóbulos rojos, utilizado en las referencias mencionadas anteriormente, esto es, los documentos JP-A 11-75892, JP-A 2004-105027, y P. H. Vianen et al., Cytometr y , 14:276-280, no puede determinar la razón de infección precisa por el siguiente motivo.

La Fig. 1 muestra un ciclo de vida de los parásitos de la malaria en los glóbulos rojos, en donde los parásitos de la malaria al chupar la sangre un mosquito anofeles, entran en el organismo y liberan merozoitos de los hepatocitos a la sangre, para entrar en los glóbulos rojos iniciando de este modo el ciclo de vida en los glóbulos rojos. En el ciclo de vida en los glóbulos rojos, el parásito de la malaria crece en forma de anillo, trofozoito y esquizonte por este orden, y el esquizonte cuando se divide en una pluralidad de merozoitos rompe el glóbulo rojo infectado para liberar merozoitos del glóbulo rojo, y los merozoitos liberados en la sangre entran en otros glóbulos rojos y vuelven a iniciar el ciclo de vida en los glóbulos rojos. El parásito de la malaria crece mediante la repetición de este... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un reactivo para lisar parcialmente una membrana celular de un glóbulo rojo infectado con un parásito de la malaria, de tal manera que un parásito de la malaria es retenido en el glóbulo rojo parcialmente lisado y pasa colorante fluorescente a través de la membrana celular parcialmente lisada, que comprende: un primer tensioactivo catiónico y un segundo tensioactivo catiónico que es diferente del primer tensioactivo catiónico; en donde el reactivo tiene un pH de 5 a 7 y una presión osmótica de 200 a 300 mOsm/kg·H2O.

2. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer y segundo tensioactivos catiónicos son las sales de amonio cuaternario que tienen grupos alquilo de cadena larga; y en donde el número de carbonos del grupo alquilo del segundo tensioactivo catiónico es más pequeño que el del grupo alquilo del primer tensioactivo catiónico.

3. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el primer tensioactivo catiónico es cloruro de esteariltrimetilamonio, y el segundo tensioactivo catiónico es cloruro de lauriltrimetilamonio.

4. El reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente:

un tensioactivo no iónico que no tiene sustancialmente la capacidad de lisis de la membrana de los glóbulos rojos.

5. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el tensioactivo no iónico se selecciona del grupo que consiste de monoisoestearato de polioxietilensorbitán, monooleato de polioxietilensorbitán, aceite de ricino polioxietilenado e hidrogenado, polioxietilenfitosterol, polioxietilenfitostanol, polioxietilenlauriléter, polioxietilenoreileter, polioxietilenpolioxipropilendeciltetradecileter, polioxietilenpolioxipropilencetiléter, y monolaurato de polioxietileno.

6. Un reactivo para detectar un glóbulo rojo infectado de malaria, que comprende:

el reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y un colorante fluorescente de tipo bisbencimida que tiene preferencia por el ADN sobre el ARN.

7. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el colorante fluorescente de tipo bisbencimida tiene la siguiente fórmula química. 35

8. Un método para el análisis de muestras para detectar glóbulos rojos infectados de malaria, que comprende: 40 (a) preparar una muestra de medición mediante la mezcla de una muestra con el reactivo de la reivindicación 6

o 7;

(b) medir la luz fluorescente y la luz dispersada por los glóbulos rojos en la muestra de medición elaborada en la etapa (a) , y

(c) detectar los glóbulos rojos infectados de malaria basándose en la luz fluorescente y la luz dispersada 45 medidas en la etapa (b) .

9. El método de análisis de la muestra de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la etapa (b) comprende

(d) introducir la muestra de medición en una celda de flujo; 50 (e) exponer la muestra de medición que fluye en la celda de flujo a la luz de excitación; y

(f) detectar la luz fluorescente y la luz dispersada por los glóbulos rojos en la muestra de medición; y en donde la etapa (c) comprende

(g) elaborar un diagrama de dispersión basándose en la intensidad de luz fluorescente y la intensidad de la luz dispersada, e identificar una zona de glóbulos rojos infectados de malaria para los glóbulos rojos infectados de malaria en el diagrama de dispersión.

10. El método de análisis de la muestra de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde la etapa (c) comprende detectar los primeros glóbulos rojos infectados de malaria y/o los segundos glóbulos rojos infectados de malaria basándose en la luz fluorescente y la luz dispersada, teniendo los primeros glóbulos rojos infectados de malaria forma de anillo sencillo y teniendo los segundos glóbulos rojos infectados de malaria dos o más formas de anillo.

11. El método de análisis de la muestra de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la etapa (c) comprende detectar y contar los glóbulos rojos infectados de malaria basándose en la luz fluorescente y la luz dispersada, y comprende obtener una razón de infección de malaria basándose en el recuento de glóbulos rojos infectados de malaria (M) .

12. El método de análisis de la muestra de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la etapa (c) comprende la detección y el recuento de glóbulos blancos basándose en la luz fluorescente y la luz dispersada, y la razón de infección con malaria se obtiene por medio de la siguiente fórmula:

razón de infección de malaria (%) = K * (M * CGB) / (W * CGR) * 100;

en donde "WBC" representa una concentración de glóbulos blancos de la muestra, "CGR" representa una concentración de glóbulos rojos de la muestra, "W" representa un recuento de glóbulos blancos, y "K" representa un número constante.

13. El método de análisis de la muestra de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la razón de infección de malaria se obtiene por medio de la siguiente fórmula;

razón de infección de malaria (%) = K * M / (CGR * V) * 100;

en donde "CGR" representa una concentración de glóbulos rojos de la muestra, "V" representa un volumen de la muestra utilizada para la preparación de la muestra de medición, y "K" representa un número constante.

14. El método de análisis de la muestra de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la razón de infección de malaria se obtiene por medio de la siguiente fórmula;

razón de infección de malaria (%) = M / (G + M) * 100;

en donde "G" representa un recuento de glóbulos rojos no infectados de malaria.

15. Un método de análisis de la muestra para detectar glóbulos rojos infectados de malaria, que comprende:

(a) mezclar una muestra de sangre con el reactivo de la reivindicación 6 o la reivindicación 7;

(b) teñir el ADN del parásito de la malaria con el colorante fluorescente;

(c) exponer la muestra que contiene los glóbulos rojos, a los que se han aplicado los tratamientos de las etapas

(a) y (b) , a luz irradiada y obtener información óptica; y

(d) distinguir entre primeros glóbulos rojos que tienen forma de anillo sencillo y segundos glóbulos rojos que tienen dos o más formas de anillo basándose en la información óptica obtenida.

16. El método de análisis de la muestra de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la información óptica comprende una primera información acerca de la luz fluorescente y una segunda información acerca de la luz dispersada que se generan mediante la exposición de la muestra a la luz irradiada.

17. El método de análisis de la muestra de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la etapa (d) comprende

(e) elaborar un diagrama de dispersión de la intensidad de la luz fluorescente y la intensidad de la luz dispersada basándose en la primera y la segunda información, e identificar una primera zona para los primeros glóbulos rojos y una segunda zona para los segundos glóbulos rojos en el diagrama de dispersión.

18. El método de análisis de la muestra de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la etapa (d) comprende adicionalmente (f) contar los primeros glóbulos rojos y los segundos glóbulos rojos.


 

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