Un péptido monofosforilado aislado derivado de alfa-enolasa humana útil para diagnóstico y tratamiento del adenocarcinoma pancreático, anticuerpos dirigidos contra dicho péptido monofosforilado, y sus usos.

Un péptido monofosforilado aislado de una longitud de 12 a 20 aminoácidos,

caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 1 y caracterizado porque contiene una sola fosforilación en el residuo de serina (S) en la posición 8 de la SEC ID N.º: 1.

Un péptido monofosforilado aislado derivado de alfa-enolasa humana útil para diagnóstico y tratamiento del adenocarcinoma pancreático, anticuerpos dirigidos contra dicho péptido monofosforilado, y sus usos 5

Campo de la invención La presente invención está en el campo del diagnóstico y tratamiento de enfermedades tumorales y en particular, del adenocarcinoma ductal pancreático, también denominado ACDP.

Más específicamente, la presente invención se refiere a un péptido monofosforilado aislado derivado de la alfaenolasa humana y a un anticuerpo dirigido específicamente contra el mismo, útil en el diagnóstico y/o tratamiento del adenocarcinoma ductal pancreático. Además, la invención hace referencia a una isoforma monofosforilada de a alfaenolasa humana que comprende el péptido monofosforilado mencionado anteriormente.

Antecedentes de la invención El ACDP es el carcinoma pancreático más frecuente y es la cuarta causa de muerte en Estados Unidos y Europa. La mayoría de los pacientes mueren en un plazo de doce meses y el porcentaje de supervivencia a cinco años desde el 20 diagnóstico es del 2 %. La pancreatectomía sigue siendo el tratamiento principal del ACDP, pero los beneficios de la misma están restringidos al 20 % de los casos en los que el diagnóstico se realizó en una etapa precoz. A pesar de las mejoras en los tratamientos médicos y quirúrgicos, incluido el uso de anticuerpos monoclonales, vacunas y quimioterapia, hasta ahora se dispone de muy pocos biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico del ACDP, que además son poco fiables. El biomarcador serológico del ACDP más usado es el antígeno sialilado del grupo sanguíneo de Lewis CA19.9, que se usa principalmente para monitorizar la respuesta a la terapia. Este antígeno puede estar presente eficazmente a concentraciones altas, incluso en el suero de pacientes con enfermedades pancreáticas benignas como la pancreatitis crónica y la obstrucción biliar, lo que tiene como resultado falsos positivos. Además, este antígeno no se expresa en el 5-10 % de la población y por tanto no es adecuado para usar en todos los pacientes de ACDP.

Por estas razones, se están investigando biomarcadores alternativos para el diagnóstico del ACDP.

La identificación de un biomarcador que sea fiable y útil en un elevado porcentaje de pacientes permitiría disminuir el uso de procedimientos invasivos, tales como obtenciones mediante biopsia y exploraciones histopatológicas.

También se podría usar un biomarcador con estas características para identificar y evaluar nuevos candidatos a fármacos para el tratamiento del ACDP.

El análisis a gran escala de la expresión de proteínas y ARN está entre las tecnologías de uso más reciente para identificar posibles biomarcadores de ACDP. En concreto, se han usado las tecnologías proteómicas para identificar 40 antígenos capaces de inducir una respuesta de anticuerpos en los pacientes con ACDP. Esto se ha realizado analizando perfiles proteicos separados mediante electroforesis bidimensional (2-DE) , reconocidos por el suero de pacientes con ACDP e identificados después mediante espectrometría de masas. Caracterizando el repertorio de los linfocitos B contra antígenos expresados específicamente por células tumorales (los denominados inmunomas del cáncer humano) , puede ser posible definir dianas específicas que estén implicadas en investigaciones 45 inmunológicas e inmunoediciones tumorales y entender los mecanismos responsables de la proliferación celular incontrolada y la metástasis.

Determinados autores han sugerido que la inmunoterapia puede ser un abordaje practicable para el cáncer pancreático. En realidad, se han generado listas de proteínas específicas del ACDP según su expresión elevada a 50 nivel de ARN (documento WO 2004/055519) o en base a los análisis proteómicos a gran escala o proteómicosserológicos usando sueros de pacientes con ACDP. No obstante, en lo que respecta a lo que saben los autores de la invención, no se ha demostrado que ninguna de estas proteínas concretas sea útil como un reactivo diagnóstico específico para el ACDP.

En la solicitud internacional de patente WO 2008037792, se comunica la existencia de seis isoformas de la alfaenolasa humana fosforilada (ENOA1-6) diferentes y el uso de una de estas isoformas, fosforilada al menos en tres posiciones, se ha reivindicado para el diagnóstico del ACDP. La descripción del documento WO 2008037792 muestra datos experimentales concernientes al análisis de la fosforilación de la isoforma ENOA3, pero esta isoforma realmente no está relacionada con el ACDP. Por el contrario, las isoformas ENOA1 y ENOA2 -relacionadas con el

ACDP- no están suficientemente caracterizadas en términos estructurales y no se ha proporcionado ningún criterio inequívoco para distinguirlas de las isoformas no relacionadas con el ACDP.

Por tanto, sigue existiendo una necesidad de detectar y caracterizar un biomarcador que sea específico y fiable para el diagnóstico precoz del ACDP, diseñado para distinguir esta grave enfermedad tumoral de otras patologías.

Sumario de la invención Estos y otros objetos se consiguen mediante un péptido monofosforilado aislado de la alfa-enolasa de una longitud de 12 a 20 aminoácidos, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos RIEEELGSKAKF (SEC ID N.º: 1) , de modo que dicho péptido contiene una única fosforilación en el residuo de serina (S) en la posición 8 de la SEC ID N.º: 1.

Como ilustración se proporciona una isoforma de la alfa-enolasa humana monofosforilada, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos comprendida entre las posiciones 2 y 434 de la SEC ID N.º: 2, de modo que dicha isoforma contiene una única fosforilación en el residuo de serina (S) en la posición 419 de la SEC ID N.º:

2.

La SEC ID N.º: 2 es la secuencia de aminoácidos de la alfa-enolasa humana disponible en la base de datos de Uni-ProtKB con el número de registro P06733.

La SEC ID N.º: 1 corresponde a las posiciones de aminoácidos de 412 a 423 de la SEC ID N.º: 2.

El residuo de serina en la posición 8 de la SEC ID N.º: 1 corresponde al residuo de serina en la posición 419 de la SEC ID N.º: 2.

En la descripción siguiente, el péptido aislado que forma el objeto de la presente invención se denominará “péptido monofosforilado”.

Un aspecto adicional de la invención es un anticuerpo diseñado para unirse específicamente al péptido monofosforilado y/o a la isoforma monofosforilada de la invención.

Otro aspecto más de la invención es un kit para el diagnóstico del adenocarcinoma ductal pancreático (ACDP) , que comprende como un reactivo específico una molécula proteica relacionada específicamente con el ACDP seleccionada del péptido monofosforilado aislado de la invención y anticuerpos diseñados para unirse específicamente al péptido monofosforilado de la invención.

Otro aspecto más de la invención es un método de inmunoensayo para el diagnóstico del ACDP, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra biológica (preferentemente suero o sangre) de un paciente del que se sospecha 35 que está afectado por adenocarcinoma ductal pancreático con el péptido fosforilado de la invención;

b) detectar si se produce una unión inmunológica específica entre el péptido y autoanticuerpos posiblemente presentes en la muestra biológica del paciente; siendo la aparición de dicha unión inmunológica específica indicativa de adenocarcinoma ductal pancreático.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de un anticuerpo diseñado para unirse específicamente al péptido monofosforilado de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico del ACDP.

Otras características de la invención se definen en las reivindicaciones adjuntas que son parte integral de la 45 descripción.

Descripción detallada de la invención La presente invención se basa en la observación, realizada por los autores de la presente invención mediante la 50 técnica de espectrometría de masas (EM) , de que las isoformas de la alfa-enolasa humana que contienen una única fosforilación en el residuo de serina (S) en la posición 419 de la SEC ID N.º: 2 se expresan de forma selectiva en el páncreas tumoral en comparación con el páncreas sano.

Dicho hallazgo es sorprendente sobre todo considerando el documento WO 2008/037792 de la técnica anterior, en 55 el que se enseña que las isoformas de la alfa-enolasa humana ENOA1 y ENOA2, relacionadas específicamente con el adenocarcinoma pancreático, están fosforiladas en al menos 3 posiciones.

Los autores... [Seguir leyendo]

1. Un péptido monofosforilado aislado de una longitud de 12 a 20 aminoácidos, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 1 y caracterizado porque contiene una sola fosforilación en el residuo de 5 serina (S) en la posición 8 de la SEC ID N.º: 1.

2. El péptido monofosforilado aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un residuo de cisteína adicional en la posición amino-terminal o carboxi-terminal.

3. El polipéptido monofosforilado aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en la SEC ID N.º: 1.

4. El péptido monofosforilado aislado de acuerdo con la reivindicación 2, que consiste en la SEC ID N.º: 3.

5. El péptido monofosforilado aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que está conjugado 15 con un vehículo.

6. El péptido monofosforilado aislado de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el vehículo se selecciona del grupo que consiste en ovoalbúmina de pollo (OVA) , seroalbúmina bovina (BSA) , hemocianina de lapa californiana, proteína de unión a la maltosa de E. coli, poliarginina, polihistidina, glutatión-S-transferasa.

7. Un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a un péptido monofosforilado aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, que es un anticuerpo monoclonal. 25

9. Un kit para el diagnóstico del adenocarcinoma ductal pancreático que comprende, como el reactivo diagnóstico específico, una molécula proteica relacionada específicamente con el adenocarcinoma ductal pancreático seleccionada del grupo que consiste en el péptido monofosforilado aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.

10. Un método de inmunoensayo para el diagnóstico in vitro del adenocarcinoma ductal pancreático, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra biológica de un paciente del que se sospecha que está afectado por 35 adenocarcinoma ductal pancreático con un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

b) detectar si se produce una unión inmunológica específica entre dicho péptido y autoanticuerpos posiblemente presentes en la muestra biológica del paciente;

siendo la aparición de dicha unión inmunológica específica indicativa de adenocarcinoma ductal pancreático.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la muestra biológica es suero o sangre.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, que es un método de ensayo inmunoenzimático o 45 radioinmunológico.

13. Una composición farmacéutica para el tratamiento terapéutico del adenocarcinoma ductal pancreático, que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 y vehículos, excipientes y/o diluyentes opcionales farmacéuticamente aceptables.

14. El uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para preparar un medicamento para el tratamiento terapéutico del adenocarcinoma ductal pancreático.