Transcetolasa modificada y uso de la misma.

Un procedimiento para la producción de sustancias para las que ribosa-5-fosfato,

ribulosa-5-fosfato, o xilulosa-5-fosfato es un precursor biosintético, que comprende cultivar un microorganismo en un medio adecuado encondiciones que permiten la expresión de una transcetolasa modificada y separar el producto de fermentación delmedio, seleccionándose dicho microorganismo de un microorganismo productor de riboflavina seleccionado deBacillus o Corynebacterium genéticamente manipulado mediante ingeniería con un polinucleótido que codifica dichatranscetolasa modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una mutación en unaposición que corresponde a la posición 357 como se muestra en SEC ID NO: 2, y en el que la velocidad decrecimiento de dicho microorganismo sobre una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la rutade fosfato de pentosa se reduce entre 10 a 90% en comparación con una célula hospedante que contiene unatranscetolasa no modificada, y en el que el microorganismo sigue siendo prototrófico para aminoácidos aromáticos.

Transcetolasa modificada y uso de la misma La presente invención proporciona enzimas transcetolasas modificadas. Los microorganismos que sintetizan una de las transcetolasas modificadas en lugar de la transcetolasa de tipo salvaje son prototrofos para aminoácidos aromáticos y no pueden usar fuentes de carbono que son asimiladas vía la ruta de fosfato de pentosa. Las enzimas modificadas y polinucleótidos que las codifican se pueden usar en el proceso de fermentación para sustancias que usan ribosa-5-fosfato, ribulosa-5-fosfato, o xilulosa-5-fosfato como sustrato para la biosíntesis, tal como, por ejemplo, riboflavina, precursores de riboflavina, mononucleótido de flavina (FMN) , dinucleótido de flavina y adenina (FAD) , y sus derivados. También se pueden usar para la producción de fosfato de piridoxal (vitamina B6) , guanosina y adenosina, y derivados de estos nucleótidos.

La riboflavina (vitamina B2) es sintetizada por todas las plantas y muchos microorganismos, pero no es producida por animales superiores. Debido a que es un precursor de coenzimas tales como el dinucleótido de flavina y adenina y el mononucleótido de flavina, que son necesarios en la oxidación enzimática de hidratos de carbono, la riboflavina es esencial para el metabolismo básico. En animales superiores, una insuficiencia de riboflavina puede provocar pérdida del cabello, inflamación de la piel, deterioro de la visión, e insuficiencia del crecimiento.

Las enzimas requeridas que catalizan la biosíntesis de riboflavina a partir de trifosfato de guanosina (GTP) y ribulosa-5-fosfato están codificadas por cuatro genes (ribG, ribB, ribA, y ribH) en B. subtilis. Estos genes están situados en un operón, cuyo orden génico difiere del orden de las reacciones enzimáticas catalizadas por las enzimas. Por ejemplo, GTP ciclohidrolasa II, que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de riboflavina, es codificada por el tercer gen en el operón, ribA. El gen ribA también codifica una segunda actividad enzimática, es decir, 3, 4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintasa (DHBPS) , que cataliza la conversión de ribulosa-5-fosfato a la unidad de cuatro carbonos 3, 4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato (DHBP) . La desaminasa y la reductasa son codificadas por el primer gen del operón, ribG. La penúltima etapa en la biosíntesis de la riboflavina está catalizada por lumazina sintasa, el producto del último gen rib, ribH. La riboflavina sintasa, que controla la última etapa de la ruta, es codificada por el segundo gen del operón, ribB. La función del gen situado en el extremo 3’ del operón rib es actualmente incierta; sin embargo, su producto génico no es necesario para la síntesis de riboflavina.

La transcripción del operón de riboflavina a partir del promotor ribP1 está controlada por un mecanismo de atenuación que implica una región líder reguladora situada entre ribP1 y ribG. Las mutaciones ribO en esta región líder dan como resultado la expresión desregulada del operón de riboflavina. La expresión desregulada también se observa en cepas que contienen mutaciones con cambio de sentido en el gen ribC. Se ha demostrado que el gen ribC codifica la flavina cinasa/FAD sintasa de B. subtilis (Mack, M., et al., J. Bacteriol., 180:950-955, 1998) . Las mutaciones desregulantes reducen la actividad de flavocinasa del producto del gen ribC dando como resultado concentraciones intracelulares reducidas de mononucleótido de flavina (FMN) , la molécula efectora del sistema regulador de riboflavina.

La manipulación mediante ingeniería de cepas de producción de riboflavina con mayores velocidades y rendimientos de producción de riboflavina se ha logrado en el pasado de muchas maneras diferentes. Por ejemplo, (1) se usó mutagénesis clásica para generar variantes con mutaciones aleatorias en el genoma del organismo de elección, seguido de la selección por mayor resistencia a análogos de purina y/o identificando una mayor producción de riboflavina. (2) Como alternativa, las enzimas terminales de la biosíntesis de riboflavina, es decir, las enzimas que catalizan la conversión de trifosfato de guanosina (GTP) y ribulosa-5-fosfato en riboflavina, estaban sobreexpresadas, dando como resultado también un mayor flujo hacia el producto diana. El flujo metabólico hacia y a través de una ruta biosintética, por ejemplo la ruta biosintética de riboflavina, está determinado por las actividades específicas de las enzimas limitantes de la velocidad de esta ruta particular, y por las concentraciones intracelulares de los sustratos para estas enzimas. Una enzima puede operar a su actividad máxima sólo a o por encima de las concentraciones de sustrato saturantes. La concentración de sustrato saturante es un rasgo característico para cada enzima. Por ejemplo, el flujo metabólico hacia la ruta de riboflavina se puede incrementar o se puede mantener en un nivel elevado manteniendo las concentraciones intracelulares de ribulosa-5-fosfato por encima o tan próximo como sea posible a la concentración de sustrato saturante de la 3, 4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintasa, una enzima limitante de la velocidad supuesta para la ruta biosintética de riboflavina. Se pueden alcanzar concentraciones intracelulares elevadas de ribulosa-5-fosfato, por ejemplo, evitando o interfiriendo con el drenaje de ribulosa-5-fosfato en el metabolismo central vía la parte no oxidativa de la ruta de fosfato de pentosa.

Una enzima clave en la parte no oxidativa de la ruta de fosfato de pentosa es la enzima transcetolasa, que cataliza la conversión reversible de ribulosa-5-fosfato y xilulosa-5-fosfato a seduheptulosa-7-fosfato y gliceraldehído-3fosfato. Además, transcetolasa cataliza también la conversión de fructosa-6-fosfato y gliceraldehído-3-fosfato en xilulosa-5-fosfato y eritrosa-4-fosfato (Kochetov, G. A. 1982, Transketolase from yeast, rat liver, and pig liver, Methods Enzymol., 90:209-23) .

Se ha dado a conocer previamente que cepas de Bacillus subtilis deficientes en transcetolasa, que poseen mutaciones de supresión génica en el gen que codifica transcetolasa, producen ribosa, que se acumula en el caldo de fermentación (De Wulf, P., y E. J. Vandamme. 1997. Production of D-ribose by fermentation, Appl. Microbiol.

Biotechnol. 48:141-148; Sasajima, K., y Yoneda, M. 1984, Production of pentoses by microorganisms. Biotechnol. and Genet. Eng. Rev. 2: 175-213) . Obviamente, se pueden alcanzar mayores conjuntos de azúcares intracelulares de C5 carbonos en mutantes a los que se les ha suprimido el gen de transcetolasa hasta un nivel que supera las necesidades fisiológicas de las bacterias y conduce a la secreción de ribosa en exceso.

Como se mencionó anteriormente, las reacciones catalizadas por transcetolasa también son necesarias para producir eritrosa-4-fosfato, a partir del cual derivan tres aminoácidos aromáticos proteinogénicos. Por lo tanto, los microorganismos deficientes en transcetolasa son auxotrofos para estos aminoácidos. Sólo pueden crecer si estos aminoácidos o sus precursores biosintéticos, por ejemplo ácido shikímico, son suministrados vía el medio de cultivo.

Además de la auxotrofia desfavorable para aminoácidos aromáticos o ácido shikímico, los mutantes de B. subtilis deficientes en transcetolasa muestran un número de graves efectos pleyotrópicos, como crecimiento muy lento en glucosa, un sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato defectuoso, represión de catabolito de carbono desregulada, y composición de la membrana celular y de la pared celular alterada (De Wulf, P., y E. J. Vandamme. 1997) .

Otra cepa de B. subtilis que segrega riboflavina deficiente en transcetolasa fue descrita por Gershanovich et al. (Gershanovich VN, Kukanova Ala, Galushkina ZM, Stepanov AI (2000) Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 3:3-7) .

Además, el documento US 6.258.554 B1 describe una cepa de Cor y nebacterium glutamicum que sobreproduce riboflavina, en la que la actividad de transcetolasa es deficiente. Se puede observar a partir de la descripción del documento US 6.258.554 B1 que la deficiencia en la actividad de transcetolasa y la auxotrofia de aminoácidos resultante fue esencial para la mejor productividad de riboflavina, puesto que un revertiente prototrófico produjo riboflavina en cantidades similares a una cepa de C. glutamicum con un antecedente de transcetolasa de tipo salvaje.

Estas desventajas, es decir, auxotrofia para aminoácidos aromáticos y otros efectos pleyotrópicos explicados anteriormente, hacen a un mutante deficiente en transcetolasa una cepa de producción menos preferible para procesos industriales estables, tales como, por ejemplo, la producción industrial de riboflavina con tal cepa.

En general, es un objeto de la presente invención proporcionar una cepa mutante de transcetolasa... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la producción de sustancias para las que ribosa-5-fosfato, ribulosa-5-fosfato, o xilulosa-5fosfato es un precursor biosintético, que comprende cultivar un microorganismo en un medio adecuado en condiciones que permiten la expresión de una transcetolasa modificada y separar el producto de fermentación del medio, seleccionándose dicho microorganismo de un microorganismo productor de riboflavina seleccionado de Bacillus o Cor y nebacterium genéticamente manipulado mediante ingeniería con un polinucleótido que codifica dicha transcetolasa modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una mutación en una posición que corresponde a la posición 357 como se muestra en SEC ID NO: 2, y en el que la velocidad de crecimiento de dicho microorganismo sobre una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa se reduce entre 10 a 90% en comparación con una célula hospedante que contiene una transcetolasa no modificada, y en el que el microorganismo sigue siendo prototrófico para aminoácidos aromáticos.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la transcetolasa es una transcetolasa de Bacillus.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polinucleótido que codifica la transcetolasa se muestra en SEC ID NO:1.

4. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el producto de fermentación se selecciona de riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, fosfato de piridoxal y uno o más de sus derivados.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que el producto de fermentación es riboflavina.

6. Uso de una transcetolasa modificada para la producción de riboflavina en un microorganismo, en el que la secuencia de aminoácidos de la transcetolasa modificada contiene al menos una mutación en una posición que corresponde a la posición 357 como se muestra en SEC ID NO:2, y en el que la velocidad de crecimiento de dicho microorganismo en una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa está reducida entre 10 a 90% en comparación con una célula hospedante que contiene una transcetolasa no modificada.

7. Uso de un microorganismo para la producción de riboflavina, seleccionándose dicho microorganismo de un microorganismo productor de riboflavina seleccionado de Bacillus o Cor y nebacterium genéticamente manipulado mediante ingeniería con un polinucleótido que codifica dicha transcetolasa modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una mutación en una posición que corresponde a la posición 357 como se muestra en SEC ID NO:2, y en el que la velocidad de crecimiento de dicho microorganismo en una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa se reduce entre 10 a 90% en comparación con una célula hospedante que contiene una transcetolasa no modificada, y en el que el microorganismo sigue siendo prototrófico para aminoácidos aromáticos.

Figura 1:

Alineamiento de secuencias múltiples CLUSTAL W (1.83)

Figura 2: