Suplemento de medios para la producción de virus.

Uso de anfotericina B como suplemento del cultivo para la propagación del virus de la gripe A o B.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/060804.

Solicitante: BAXTER HEALTHCARE SA.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: THURGAUERSTRASSE 130 8152 GLATTPARK (OPFIKON) SUIZA.

Inventor/es: EGOROV,ANDREJ, ROETHL,ELISABETH.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N7/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).

PDF original: ES-2403098_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Suplemento de medios para la producción de virus La presente invención propone el uso de anfotericina B como suplemento del cultivo para la propagación de los virus de la gripe A o B.

Además, se describen una composición farmacéutica que comprende un virus y anfotericina B, y su uso en la terapia del cáncer y en el tratamiento de la gripe.

En la actualidad, se producen numerosas vacunas víricas diferentes de las de la gripe usando células primarias tripsinizadas, por ejemplo células renales de mono, así como de riñón de conejo y hámster (véase, por ejemplo, el documento WO9738094) . Los cultivos de células primarias diploides tienen determinadas ventajas tales como una preparación sencilla usando medios simples y sueros bovinos, con sensibilidad frente a una extensa gama de virus múltiples. Sin embargo, las células primarias diploides presentan inconvenientes tales como la contaminación por diversos agentes adventicios y calidad y sensibilidad variables; así como la dificultad para obtener tejidos apropiados para el cultivo (por ejemplo, riñones de mono) .

Por el contrario, las ventajas de utilizar líneas celulares continuas son su conservación de las características antigénicas originales del virus infeccioso, estandarización, alta susceptibilidad a variantes del mismo virus, y la capacidad para cultivarlos como una masa de células de gran tamaño usando sistemas de fermentación de microportadores o en suspensión.

No obstante, estas ventajas en sí mismas determinan que estas líneas celulares sean adecuadas para ser usadas en la producción de vacunas. Mizrahi, ed., Viral Vaccines, Wiley-Liss, Nueva York (1990) , páginas 39-67. Por ejemplo, el virus de la gripe A cultivado y sometido a pasajes exclusivamente en cultivos de células de mamíferos ha demostrado en ciertos casos que conserva la mayor parte o la totalidad de sus características antigénicas originales, una cualidad que podría resultar altamente beneficiosa en la producción de vacunas. (Romanova J. et al., Virology, 2003, 307 (1) :90-7; Romanova J. et al., Virus Res. 2004, 103:187-93) .

Sin embargo, las células primarias diploides de mamífero presentan dificultades como sistemas hospedadores para la producción de vacunas. Esto se debe a problemas tales como la contaminación del cultivo celular por agentes adventicios, una calidad variable de las células en el cultivo celular, diferentes sensibilidades de las células a diferentes variantes del mismo virus, títulos virales bajos, y los elevados costos y las dificultades que entrañan la obtención y preparación de tales cultivos celulares.

Adicionalmente, entre las líneas celulares continuas estudiadas, solamente las células MDCK han demostrado ser útiles para conseguir potencialmente un crecimiento y aislamiento suficientes de virus (Frank et al., J. Clin. Microb. 10:3236 (1979) ; Schepetink y Kok, J. Virol. Methods 42:241-250 (1993) ) .

Otras dos líneas celulares continuas – células del riñón del mono verde africano (Vero) y del riñón del hámster recién nacido (BK-21) – han sido caracterizadas, autorizadas y certificadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS/WHO) para la producción de vacunas humanas. Sin embargo, las células Vero, aunque están autorizadas, anteriormente se consideraron inapropiadas para la producción a gran escala de vacunas humanas contra el virus de la gripe. Por ejemplo, el crecimiento del virus de la gripe B en células Vero estuvo fuertemente limitado en comparación con las células MDCK (Nakamura et al., J. Gen. Virol. 56:199-202 (1981) . Adicionalmente, los intentos de utilizar células Vero para evaluar la sensibilidad a rimantadina de los virus de la gripe A humana H1N1 y H3N2 proporcionaron resultados ambiguos debido a los bajos títulos de virus producidos en estas células, en comparación con las células MDCK (Gorvakova EA el al., J. Virol., 1996, 70:5519-24) .

De este modo, estos y otros estudios indican que, con anterioridad, los virus de la gripe no habían replicado correctamente en células Vero, haciéndolas inadecuadas para la producción de vacunas a gran escala. (Demidova et al., Vopr. Virosol (en ruso) 346-352 (1979) ; Lau y Scholtissek, Virology 212:225-231 (1995) ) .

Kaverin NV y Webster RG (J. Virol., 1995, 69 (4) :2700-3) describieron la necesidad de la adición repetida de tripsina al medio de cultivo de células Vero infectadas con virus de la gripe para restablecer el patrón de crecimiento multicíclico de las cepas del virus de la gripe A. Ahora bien, la adición repetida de tripsina es una tarea bastante laboriosa y requiere mucho tiempo, puesto que la adición debe realizarse en diversas etapas del cultivo (véase también Gorvakova EA et al., J. Infect. Dis., 1995, 172:250-3) .

Los miembros de la familia de los virus ADN contienen genomas de doble cadena. La familia de los parvoviridae es la única excepción. La mayor parte de los genomas ADN no son simples moléculas lineales. Por ejemplo, los genomas de papoavirus son círculos de doble cadena, cerrados covalentemente, y los genomas de hepadnavirus son círculos dobles en los que una cadena contiene una mella (“nick”) y la otra contiene un espacio (“gap”) . Los extremos del genoma de doble cadena de poxvirus están unidos covalentemente, en tanto que los genomas de herpesvirus contienen duplicaciones terminales e internas.

Los virus ADN se clasifican en las familias siguientes: Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Iridoviridae, Bacuoloviridae y Poxviridae.

Los virus ARN de doble cadena se clasifican en los dos grupos de Reoviridae y Birnaviridae.

Las familias de virus que contienen ARN monocatenario envuelto del genoma de sentido negativo se clasifican en grupos que tienen genomas no segmentados (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae y Virus de la Enfermedad de Borna, Togaviridae) , o aquellos que tienen genomas segmentados (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae y Arenaviridae) . La familia Orthomyxoviridae incluye los virus de la gripe, virus de tipos A, B y C, así como los virus Thogoto y Dhori, y el virus de la anemia infecciosa del salmón.

Los viriones de la gripe consisten en un núcleo interno de ribonucleoproteína (una nucleocápside helicoidal) que contiene el genoma de ARN monocatenario, y una envuelta de lipoproteína exterior revestida en su cara interna por una proteína de matriz (M1) . El genoma segmentado del virus de la gripe A consiste en ocho moléculas (siete en el caso de la gripe C) de ARN monocatenario, lineal y de polaridad negativa que codifican diez polipéptidos, incluidos: las proteínas de polimerasa ARN, ARN-dependientes (PB2, PB1 y PA) , y la nucleoproteína (NP) , que forma de nucleocápside; las proteínas de la membrana de matriz (M1, M2) ; dos glicoproteínas de superficie que se proyectan desde la envuelta que contiene lípidos: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) ; la proteína no estructural (NS1) y la proteína de exportación nuclear (NEP) .

La transcripción y replicación del genoma tienen lugar en el núcleo y el ensamblaje se realiza a través de germinación en la membrana plasmática. Los virus pueden recombinar genes durante infecciones mixtas. El virus de la gripe se adsorbe a través de la HA a los sialiloligosacáridos en las glicoproteínas y glicolípidos de la membrana celular. Tras la endocitosis del virión, se produce una variación conformacional de la molécula de HA en el interior del endosoma celular que facilita la fusión de la membrana, desencadenando de esta forma la pérdida de la envuelta. La nucleocápside migra hacia el núcleo, en donde se transcribe el ARNm viral. El ARNm viral se transcribe por medio de un mecanismo único en el que la endonucleasa viral escinde el extremo 5’ terminal provisto de caperuza desde los ARNm heterólogos celulares que, a continuación, actúan como cebadores para la transcripción de las cadenas de molde de ARN viral mediante la transcriptasa viral. Los transcritos finalizan en los sitios 15 a 22 bases de los extremos de sus moldes, en donde secuencias oligo (U) actúan como señales para la adición de colas poli (A) . De las ocho moléculas de ARN viral producidas de esta forma, seis son mensajes monocistrónicos que se traducen directamente en las proteínas que representan HA, NA, NP, y las proteínas de polimerasa viral, PB2, PB1 y PA. Los otros dos transcritos experimentan empalme, proporcionando dos ARNm que se traducen en diferentes marcos de lectura para producir M1, M2, NS1 y NEP. Dicho en otras palabras, los ocho segmentos de ARN viral codifican once proteínas: nueve proteínas estructurales y no estructurales y la proteína identificada recientemente PB1-F2.

A la vista de las dificultades para la producción... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Uso de anfotericina B como suplemento del cultivo para la propagación del virus de la gripe A o B.

2. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la anfotericina B se encuentra en una concentración de entre 0, 5 ng/ml y 5 microgramos/ml, preferiblemente entre 0, 5 ng/ml y 2, 5 microgramos/ml, preferiblemente entre 10 ng/ml y 900 ng/ml, más preferiblemente entre 100 ng/ml y 500 ng/ml y, de forma más preferida, entre 200 ng/ml y 400 ng/ml.

3. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el virus ARN contiene una modificación en los genes NS1 y/o PB1.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la modificación es una deleción, sustitución o inserción de al menos un ácido nucleico.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el virus es un virus oncolítico.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en células BSC-1, células LLC-MK, células CV-1, células CHO, células COS, células de ratón, células humanas, células HeLa, células 293, células VERO, células MDBK, células MDCK, células MDOK, células CRFK, células RAF, células TCMK, células LLC-PK, células PK15, células WI-38, células MRC-5, células T-FLY, células BHK, células SP2/0, NSO, PerC6 (células de la retina humana) , células de embrión de pollo o sus derivados, células de huevos embrionados, huevos de pollo embrionados o sus derivados.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, con el que consigue un incremento del crecimiento viral de al menos 0, 1 log10, preferiblemente de al menos 0, 5 log10, más preferiblemente de al menos 1 log10, más preferiblemente de al menos 2 log10, todavía más preferiblemente de al menos 2, 5 log10.

8. Uso de anfotericina B para la transfección de células Vero con plásmidos de expresión que contienen segmentos de ARN de los virus de la gripe A o B.

9. Método para la infección de células para el cultivo de virus de la gripe A o B, utilizando anfotericina B, que comprende las etapas siguientes: a) las células se infectan con al menos una partícula infecciosa del virus de la gripe A o B, b) se agrega anfotericina B al inóculo y/o a los medios de cultivo, junto con tripsina, c) incubación bajo condiciones apropiadas, seguida de

d) recolección de la producción viral y, opcionalmente, e) purificación y/o caracterización de los virus.

10. Formulación farmacéutica que comprende virus vivos atenuados y anfotericina B, en donde el virus se selecciona del grupo que consiste en virus de la gripe A o B.

11. Uso de una preparación farmacéutica según la reivindicación 10 para la preparación de un medicamento para la terapia viral del cáncer o el tratamiento de la infección de gripe.

12. Método para el aislamiento de virus de la gripe a partir de muestras clínicas, en el que a) se infectan células con partículas virales de las vías respiratorias del paciente, en presencia de anfotericina B, b) se incuban las células bajo condiciones apropiadas para estimular el crecimiento del virus en presencia de

anfotericina B, y c) aislamiento y caracterización del virus.


 

Patentes similares o relacionadas:

Métodos mejorados para la preparación de escualeno, del 15 de Julio de 2020, de NOVARTIS AG: Un procedimiento para la preparación de escualeno a partir de una composición que comprende escualeno a partir de una fuente animal, dicho procedimiento comprendiendo […]

Señal para el empaquetamiento de vectores del virus de la gripe, del 24 de Junio de 2020, de WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION: Un vector del virus de la gripe para la expresión y empaquetamiento de ARNv recombinante, en el que el vector comprende: secuencias correspondientes […]

Nueva especie de tobamovirus, del 17 de Junio de 2020, de Nunhems B.V: Un tobamovirus cuyo genoma comprende al menos 83% de identidad de secuencia con la SEQ ID NÚM.: 1 y en el que el virus causa síntomas sistémicos en plantas homocigotas […]

Vectores de AAV dirigidos a oligodendrocitos, del 10 de Junio de 2020, de THE UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA AT CHAPEL HILL: Un ácido nucleico que codifica una cápside de AAV, comprendiendo el ácido nucleico una secuencia codificante de la cápside de AAV que es al menos el 96 % idéntica […]

Métodos para la transducción y el procesamiento de células, del 27 de Mayo de 2020, de Juno Therapeutics, Inc: Un método de transducción, que comprende incubar, en una cavidad interna de una cámara de centrífuga, una composición de entrada que comprende células y partículas […]

Composiciones para tratar MPSI, del 22 de Abril de 2020, de THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA: Un vector que lleva un casete de expresión que comprende un gen de la alfa-L-iduronidasa humana (hIDUA) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: […]

Métodos mejorados para producir terapias celulares adoptivas, del 22 de Abril de 2020, de Bluebird Bio, Inc: Un método in vitro para producir un producto terapéutico de células T que comprende: a) proporcionar una población de células mononucleares […]

Imagen de 'Inmunógenos de anticuerpos ampliamente neutralizantes del VIH-1,…'Inmunógenos de anticuerpos ampliamente neutralizantes del VIH-1, métodos de generación y usos de los mismos, del 25 de Marzo de 2020, de INTERNATIONAL AIDS VACCINE INITIATIVE: Un inmunógeno 10E8 que consiste en la secuencia de aminoácidos: **(Ver fórmula)**

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .