Sistema automatizado para separaciones electroforéticas de alta capacidad de producción.

Una cajeta (10) destinada a acoplarse con una estación de acoplamiento existente en un aparato deelectroforesis,

de manera que la cajeta comprende:

un alojamiento, que tiene una parte superior (12) y una parte inferior (14);

un soporte (24) de sustrato situado dentro del alojamiento, entre las partes superior e inferior (12, 14), de talmodo que el soporte (24) de sustrato está configurado para recibir un sustrato de electroforesis (22);

al menos dos electrodos (20), situados dentro del alojamiento, en lados opuestos del soporte (24) de sustrato; y

al menos un contacto eléctrico, situado en una superficie externa del alojamiento y conectado eléctricamente aal menos uno de los electrodos (20) con el fin de permitir el paso de corriente entre el contacto eléctrico y elelectrodo;

caracterizada por al menos dos depósitos (16) de líquido, proporcionados dentro del alojamiento, entre laspartes superior e inferior (12, 14), para albergar una solución tampón o amortiguadora líquida, y cada uno deellos capaz de estar en contacto con una sección de un sustrato de electroforesis (22); de tal modo que cadadepósito (16) de líquido contiene un electrodo (20) y está formado en el alojamiento, a cada lado del soporte(24) de sustrato, y por unos accesos o lumbreras (30) para líquido, formadas en el alojamiento y que seextienden hasta una superficie externa de la cajeta (10), de tal manera que las lumbreras están encomunicación de fluido con los depósitos (16) para conectar cada depósito (16) con una fuente de suministro desolución amortiguadora y un recipiente de desecho, a fin de suministrar y extraer líquidos hacia, y desde, lacajeta (10).

Sistema automatizado para separaciones electroforéticas de alta capacidad de producción.

Antecedentes de la invención La electroforesis con gel es ampliamente utilizada para separar mezclas complejas de especies moleculares, en particular, proteínas, ácidos nucleicos, ADN. Existen principalmente dos métodos para llevar a cabo un procedimiento electroforético: en una dimensión, o unidimensionalmente, y en dos dimensiones, o bidimensionalmente. En su forma más simple, la electroforesis con gel en una dimensión (“1D”) implica, por lo común: (1) colocar la (s) muestra (s) que se ha (n) de separar a lo largo de, o cerca de, uno de los bordes de una losa o placa de gel de separación (al que se hace referencia en lo que sigue de la presente memoria simplemente como un “gel”) , lo que hace que una solución tampón o amortiguadora electroforética contenida en un pozo o depósito entre en contacto con el borde donde están situadas las muestras, y hace que una solución amortiguadora electroforética contenida en un segundo pozo entre en contacto con el borde opuesto del gel, y (3) aplicar una diferencia de tensiones eléctricas (a la que se hace referencia en lo sucesivo de esta memoria como una “tensión”) a los electrodos inmersos en cada pozo. La aplicación de la tensión hace que se establezca un campo eléctrico en el seno del gel. El campo eléctrico, a su vez, provoca que la especie molecular de cada muestra migre en el seno del gel en diferentes velocidades. La velocidad de migración se determina basándose en la forma molecular y/o la carga de la especie molecular, así como en el tipo de gel y de la solución amortiguadora. Una vez que se ha completado la migración, puede llevarse a cabo una etapa de pigmentación en la que las especies moleculares, separadas, son vertidas de manera que impregnan una membrana de fluoruro de polivinilideno (“PVDF” –“polyvinylidene fluoride”) (una membrana de nilón, en el caso de ácido nucleicos) y son entonces reveladas por manchado con un pigmento.

En los últimos años, el procedimiento implicado en la realización de la electroforesis con gel ha sido simplificado considerablemente a través del uso de geles previamente colados disponibles comercialmente. Antes de esto, los geles se fabricaban según se necesitaban en los laboratorios de ensayo. Puesto que los geles son, por lo común, muy frágiles, es necesario proteger los geles durante su transporte desde el fabricante hasta el laboratorio de ensayo, así como durante su almacenamiento. Muchos de los geles previamente colocados de que se dispone en el mercado se venden emparedados entre placas protectoras de plástico o de vidrio rígidas, en tanto que algunos de ellos tienen simplemente un respaldo o base de plástico flexible y son almacenados dentro de bolsas cerradas al vacío. Existen también algunos fabricantes que suministras geles en cajetas. En el campo de la electroforesis con gel, el término “cajeta” se refiere generalmente a una estructura rígida que tiene un gel situado en su interior. Tales cajetas no solo actúan protegiendo el gel, sino que también proporcionan un mecanismo cómodo para transportar el gel antes, durante y después del procedimiento de electroforesis.

Las etapas descritas anteriormente para llevar a efecto el procedimiento de electroforesis pueden llevarse a cabo ya sea en la dirección vertical, ya sea en la dirección horizontal. En la electroforesis con gel vertical, el gel se coloca, por lo común, dentro de una cajeta que está abierta por sus dos extremos. Cada extremo se encuentra en comunicación de fluido con un pozo diferente que contiene una solución tampón o amortiguadora. Uno de los pozos está situado, por lo común, por encima de la cajeta, y el otro, por debajo. La cajeta sirve, con frecuencia, al menos como parte de una de las paredes del pozo de solución amortiguadora superior. Las cajetas que se emplean, por lo común, en los procedimientos de electroforesis vertical contienen únicamente el gel (es decir, no tienen soluciones amortiguadoras ni electrodos) . De esta forma, se necesitan pozos separados en la electroforesis con gel vertical para proporcionar la fuente para la solución amortiguadora, así como los electrodos para proporcionar la tensión. Las Patentes de los EE.UU. Nos. 5.736.022 y 6.027.628 describen cajetas convencionales para uso en la electroforesis con gel vertical.

La disipación del calor constituye un problema principal durante la electroforesis con gel. A medida que la corriente eléctrica pasa a través del gel, la solución amortiguadora y el gel comienzan a calentarse. Conforme aumenta el calor, este tiene un efecto perjudicial sobre el gel. Si el calor no es disipado, el gel comenzará a descomponerse. De acuerdo con ello, se han invertido grandes esfuerzos en los últimos años en desarrollar sistemas de refrigeración que disipen el calor generado durante el procedimiento.

La Patente de los EE.UU. Nº 5.888.369 describe la incorporación de un intercambiador de calor externo en un aparato de electroforesis con gel vertical, para la circulación y refrigeración de la solución amortiguadora o tampón. El aparato da acomodo a cajetas que actúan separando los dos pozos de solución amortiguadora. Se han formado unos accesos o lumbreras en una de las paredes de los pozos de solución amortiguadora con el fin de canalizar la solución amortiguadora al intercambiador de calor para su refrigeración.

En la electroforesis con gel horizontal, el gel está orientado predominantemente en la dirección horizontal. Existen dos tipos generales de disposiciones de electroforesis con gel horizontal. En la primera disposición, el gel se coloca sobre una losa o placa situada por encima de los dos pozos de solución amortiguadora. Cada extremo del gel está en contacto con una mecha trenzada porosa que tiene un extremo colocado en el seno de la solución amortiguadora situada dentro de un pozo de solución amortiguadora. La mecha trenzada transporta una cantidad suficiente de solución amortiguadora y de corriente eléctrica desde el pozo de solución amortiguadora hasta el gel. En la segunda disposición, el gel es sumergido bajo una delgada capa de solución amortiguadora, que se extiende desde uno de los pozos hasta el otro. Esto recibe, por lo común, la denominación de electroforesis con gel “submarina”, puesto que el gel esta, al menos parcialmente, sumergido.

La Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. Nº 20010037940 describe una cajeta convencional para uso en un aparato de electroforesis con gel horizontal. La cajeta sirve, de nuevo, para separar los dos pozos de solución amortiguadora del aparato. Se trata, esencialmente, de una adaptación horizontal del aparato vertical convencional. La cajeta incluye un gel que se extiende al interior de dos depósitos internos a la cajeta (que están inicialmente vacíos) . Los dos depósitos están situados en lados opuestos del gel. Cuando la cajeta es insertada en el aparato de electroforesis con gel horizontal, cada depósito de la cajeta se comunica, a través de unas aberturas laterales, con uno de los pozos de solución amortiguadora existente en el aparato. Los pozos de solución amortiguadora del aparato contienen los electrodos para suministrar la tensión. De esta forma, cuando los pozos de solución amortiguadora del aparato se llenan de solución amortiguadora, la solución amortiguadora fluye al interior de los depósitos de la cajeta a través de la aberturas laterales y contacta con cada extremo del gel. Una vez llevado a efecto cada procedimiento de electroforesis, los pozos de solución amortiguadora del aparato son vaciados manualmente y, a continuación, se extrae la cajeta. Los depósitos de la cajeta han de ser vaciados por separado.

Si bien la electroforesis con gel ha llegado a ser omnipresente en los laboratorios de biología molecular, ha seguido siendo un procedimiento laborioso y que lleva mucho tiempo, y que se ha resistido en gran medida a la automatización debido a la necesidad de la intervención humana en diversas instancias. Estas incluyen no solo el llenado y el vaciado de los pozos de solución amortiguadora, sino también la extracción del gel, el vertido de las especies moleculares por separado de manera que impregnen una membrana y, a continuación, su manchado o tintado. Se han adoptado algunos pasos para minimizar o eliminar algunas de las etapas más laboriosas. Por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. Nos. 3.715.295, 3.865.712, 5.582.702 y 5.865.974 describen cajetas autoportantes que incluyen un gel previamente colado, electrodos y una solución amortiguadora. Estas cajetas tan solo requieren la conexión a una fuente de tensión para su funcionamiento. Tales cajetas autoportantes... [Seguir leyendo]

1. Una cajeta (10) destinada a acoplarse con una estación de acoplamiento existente en un aparato de electroforesis, de manera que la cajeta comprende:

un alojamiento, que tiene una parte superior (12) y una parte inferior (14) ;

un soporte (24) de sustrato situado dentro del alojamiento, entre las partes superior e inferior (12, 14) , de tal modo que el soporte (24) de sustrato está configurado para recibir un sustrato de electroforesis (22) ;

al menos dos electrodos (20) , situados dentro del alojamiento, en lados opuestos del soporte (24) de sustrato; y

al menos un contacto eléctrico, situado en una superficie externa del alojamiento y conectado eléctricamente a al menos uno de los electrodos (20) con el fin de permitir el paso de corriente entre el contacto eléctrico y el electrodo;

caracterizada por al menos dos depósitos (16) de líquido, proporcionados dentro del alojamiento, entre las partes superior e inferior (12, 14) , para albergar una solución tampón o amortiguadora líquida, y cada uno de ellos capaz de estar en contacto con una sección de un sustrato de electroforesis (22) ; de tal modo que cada depósito (16) de líquido contiene un electrodo (20) y está formado en el alojamiento, a cada lado del soporte (24) de sustrato, y por unos accesos o lumbreras (30) para líquido, formadas en el alojamiento y que se extienden hasta una superficie externa de la cajeta (10) , de tal manera que las lumbreras están en comunicación de fluido con los depósitos (16) para conectar cada depósito (16) con una fuente de suministro de solución amortiguadora y un recipiente de desecho, a fin de suministrar y extraer líquidos hacia, y desde, la cajeta (10) .

2. La cajeta (10) de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un sustrato electroforético (22) , dispuesto sobre el soporte (24) de sustrato, de tal manera que el sustrato incluye al menos dos extremos opuestos, de forma que cada extremo se extiende al interior de uno de los depósitos (16) de líquido.

3. La cajeta (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual existe al menos otra lumbrera (32) , configurada para canalizar gas al interior y/o al exterior del alojamiento.

4. La cajeta (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la parte superior (12) está separada del soporte (24) de sustrato para así definir un depósito (46) de sustrato sobre el soporte (24) de sustrato, y en la cual existe una lumbrera adicional (28) formada en el alojamiento y que se extiende hasta una superficie exterior del alojamiento, la cual permite el paso de fluido al interior y al exterior del depósito (46) de sustrato.

5. La cajeta (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual al menos una porción de la parte superior (12) es movible con respecto al soporte (24) de sustrato cuando la parte superior (12) se acopla o contacta con la parte inferior (14) .

6. La cajeta (10) de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la porción de la parte superior que es movible es una cubierta (12) que abarca o se extiende sobre al menos una porción del soporte (24) de sustrato con el fin de permitir el acceso al soporte (24) de sustrato; y en la cual la cubierta está fijada articuladamente al alojamiento.

7. La cajeta (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual las lumbreras (30) para líquido y el (los) contacto (s) eléctrico (s) (20) están situados en la misma superficie del alojamiento.

8. La cajeta (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual el sustrato (24) de soporte está fijado de forma desmontable o extraíble al alojamiento.

9. Un método para llevar a cabo electroforesis que comprende las etapas de:

proporcionar una cajeta (10) destinada a acoplarse con una estación de acoplamiento existente en un aparato de electroforesis, la cual comprende un alojamiento que tiene una parte superior (12) y una parte inferior (14) , un soporte (24) de sustrato, situado entre la parte superior (12) y la parte inferior (14) , un sustrato de electroforesis (22) , dispuesto sobre el soporte y que tiene unos extremos opuestos, unos accesos o lumbreras (30) para líquido, que se extienden dentro de la cajeta (10) , al menos dos electrodos (20) , situados dentro de la cajeta (10) , en lados opuestos del soporte (24) de sustrato, al menos un contacto eléctrico, situado en una superficie externa del alojamiento y que está conectado eléctricamente a al menos uno de los electrodos (20) con el fin de permitir el paso de corriente entre el contacto eléctrico y el electrodo (20) , y dos depósitos (16) de líquido, proporcionados en el interior del alojamiento, entre las partes superior e inferior (12, 14) , para albergar una solución tampón o amortiguadora líquida, y cada uno de ellos capaz de estar en contacto con una sección del sustrato de electroforesis (22) , de tal manera que cada depósito (16) de líquido contiene uno de los al menos dos electrodos (20) y está formado en el alojamiento, a cada lado del sustrato (24) de soporte, de tal modo que cada extremo del sustrato de electroforesis (22) se extiende dentro de uno de los depósitos (16) de líquido;

proporcionar un aparato de electroforesis que tiene una estación de acoplamiento (512) para recibir una cajeta (10) , una fuente de suministro (504) de solución amortiguadora líquida, un recipiente de desecho y una fuente de alimentación de energía (508) , de tal manera que las lumbreras (30) están en comunicación de fluido con los depósitos (16) y conectan cada depósito a la fuente de suministro (504) de solución amortiguadora y al recipiente de desecho;

acoplar la cajeta (10) en la estación de acoplamiento (512) del aparato de tal manera que la fuente de suministro (504) de solución amortiguadora líquida y el recipiente de desecho están en comunicación de fluido con las lumbreras (30) , y de modo que la fuente de alimentación de energía (508) se encuentra en comunicación eléctrica con al menos dos de los electrodos (20) a través del al menos un contacto eléctrico;

colocar una muestra que se ha de ensayar sobre el sustrato (22) ;

suministrar solución amortiguadora desde la fuente de suministro (504) de solución amortiguadora existente dentro del aparato, a las lumbreras (30) ; saturar el sustrato (22) con la solución amortiguadora; suministrar energía desde el aparato a al menos dos de los electrodos (20) para producir la separación; suprimir la energía de los electrodos (20) ; canalizar la solución amortiguadora utilizada desde la cajeta (10) hasta el recipiente de desecho existente en el

aparato; y analizar la separación del sustrato.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, de tal manera que, antes de la etapa de analizar la separación del sustrato, el método comprende las etapas de: suministrar una segunda solución amortiguadora desde el aparato a la cajeta (10) ; saturar el sustrato (22) con la segunda solución amortiguadora; suministrar energía desde el aparato a al menos dos de los electrodos (20) para producir una segunda separación; suprimir la energía de los electrodos (20) ; y canalizar la solución amortiguadora utilizada desde la cajeta (10) hasta el recipiente de desecho existente en el

aparato.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el cual el aparato incluye un sistema de identificación, de tal manera que el método comprende las etapas de:

utilizar el sistema de identificación para recibir información desde un dispositivo de identificación asociado con el sustrato (22) o con la cajeta (10) ; y controlar el análisis de electroforesis basándose en la información recibida.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual la etapa de controlar el análisis de electroforesis implica seleccionar una solución amortiguadora basándose en el tipo de sustrato (22) presente en la cajeta (10) .

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 y 12, en el cual la etapa de saturar el sustrato (22) implica canalizar la solución amortiguadora al interior de los depósitos (16) y al interior del sustrato (22) .

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el cual el aparato incluye múltiples estaciones de acoplamiento (512) , cada una de ellas configurada para recibir una cajeta (10) , y de manera que el método comprende, adicionalmente, las etapas de acoplar cajetas adicionales (10) , cada una de ellas en una estación de acoplamiento (512) independiente y con sus propios sustrato (22) y muestra específicos, y producir una separación electroforética de la muestra en cada sustrato (22) .

15. Un aparato de electroforesis que comprende:

una estación de acoplamiento (512) destinada a recibir una cajeta (10) que comprende un alojamiento que tiene una parte superior (12) y una parte inferior (14) , y al menos un contacto eléctrico situado en una superficie externa del alojamiento;

al menos un contacto eléctrico situado en la estación de acoplamiento (512) , de tal manera que el contacto eléctrico es susceptible de conectarse eléctricamente a una fuente de alimentación de energía (508) para suministrar corriente al contacto; caracterizado por

al menos una fuente de suministro (504) de solución amortiguadora;

un recipiente de almacenamiento de desecho;

un colector (100) de líquido, que incluye al menos un dispensador situado en la estación de acoplamiento (512) y susceptible de hacerse funcionar para la comunicación de líquido con unas lumbreras (30) para líquido de una cajeta (10) que es recibida dentro de la estación de acoplamiento (512) , una pluralidad de conductos para transportar líquido desde la fuente de suministro (504) de solución amortiguadora hasta las lumbreras (30) para líquido y para transportar desecho desde las lumbreras (30) para líquido de la estación de acoplamiento (512) hasta el recipiente de desecho, y al menos una válvula para controlar el flujo a través del dispensador; y

un controlador (510) para controlar el funcionamiento de las válvulas.

16. Un aparato de electroforesis de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende adicionalmente un colector

(102) de gas que incluye al menos un dispensador en la estación de acoplamiento (512) , al menos un conducto para transportar gas entre una fuente de suministro (506) de gas y el dispensador, y al menos una válvula para controlar el flujo a través del dispensador; y la al menos una fuente de suministro (506) de gas.

17. Un aparato de electroforesis de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el cual existen una pluralidad de contactos eléctricos situados en la estación de acoplamiento (512) ; en el que la conexión eléctrica consiste en un colector eléctrico (502) que incluye dos terminales eléctricos para conexión a la fuente de alimentación de energía (508) , y un conmutador conectado a los terminales y a los contactos eléctricos para conmutar la conexión eléctrica entre los contactos; y en el cual el controlador (510) controla la conmutación del conmutador.

18. Un aparato de electroforesis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que existen una pluralidad de dispensadores; y en el cual el controlador (502) controla selectivamente la apertura y el cierre de válvulas con el fin de controlar el flujo de líquido desde los diferentes dispensadores.

19. Un aparato de electroforesis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, que comprende adicionalmente un sistema de identificación situado para leer indicios o indicaciones asociadas con una cajeta (10) o con un sustrato (22) , de tal manera que el sistema de identificación está configurado para suministrar señales al controlador (502) basándose en los indicios.

20. Un aparato de electroforesis de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual el controlador (502) incluye una pluralidad de procedimientos de proceso de electroforesis almacenados, de tal modo que el controlador (502) selecciona un procedimiento de proceso apropiado basándose en las señales suministradas.

21. Un aparato de electroforesis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, de tal manera que el aparato incluye múltiples estaciones de acoplamiento (512) , estando cada estación de acoplamiento configurada para recibir una cajeta (10) , y de modo que el controlador (512) controla la separación electroforética de una muestra dentro de cada cajeta (10) .