Secuencias genéticas de flavonoide 3'',5''-hidroxilasa y usos para las mismas.

Una molécula de ácido nucleico aislada para su uso como promotor que es operable en tejido de pétalo de rosaque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:

5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia denucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:5 o SEQ IDNO:30 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con al menos una de SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:30 oun complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad.

Secuencias genéticas de flavonoide 3', 5'-hidroxilasa y usos para las mismas

Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere a promotores que operan eficientemente en rosales y pueden también operar en plantas tales como gerbera o plantas botánicamente relacionadas. También se desvela una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de flavonoide 3', 5'-hidroxilasa (F3'5'H) y el uso de la secuencia genética y/o sus correspondientes polipéptidos, entre otros, para manipular el color en las flores o partes de las mismas o en otros tejidos de plantas. El F3'5'H tiene la capacidad de modular el metabolismo del dihidrocanferol (DHK) , además del metabolismo de otros sustratos tales como dihidroquercetina (DHQ) , naringenina y eriodictol. También se desvela una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H cuando se expresa en rosa o gerbera o plantas botánicamente relacionadas. En el presente documento también se desvelan moléculas antisentido y sentido o moléculas inductoras de ARNi correspondientes a toda o parte de la secuencia genética anteriormente mencionada o un transcrito de la misma, además de plantas genéticamente modificadas, flores cortadas, partes y tejido reproductivo de tales plantas.

Descripción de técnica anterior

Referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forme parte del conocimiento general

común en cualquier país.

Los detalles bibliográficos de las referencias proporcionadas en la memoria descriptiva objeto se enumeran al final de la memoria descriptiva.

La industria de las flores o las plantas ornamentales procura desarrollar nuevas y diferentes variedades de flores y/o plantas. Una manera eficaz de crear tales variedades novedosas es a través de la manipulación del color de las flores. Las técnicas de cruce clásicas han sido utilizadas con algún éxito para producir una amplia gama de colores de casi todas las variedades comerciales de flores y/o plantas disponibles hoy en día. Sin embargo, esta metodología ha estado limitada por las restricciones de un conjunto de gens de especies particular y por esta razón es raro que una especie individual tenga el espectro completo de variedades coloreadas. Por ejemplo, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de plantas o partes de plantas tales como flores, follaje y tallos ofrecería una oportunidad significativa tanto a los mercados de flor cortada como a los ornamentales. En la industria de las flores o las plantas ornamentales, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de especies de florecimiento importantes tales como rosa, crisantemo, tulipán, lirio, clavel, gerbera, orquídea, lisianthus, begonia, torenia, geranio, petunia, nierembergia, pelargonio, iris, impatiens y ciclamen sería de gran interés. Un ejemplo más específico sería el desarrollo de una rosa o gerbera azul para el mercado de flor cortada.

Además, el desarrollo de novedosas variedades coloreadas de partes de plantas tales como verduras, frutos y semillas ofrecería oportunidades significativas en la agricultura. Por ejemplo, semillas coloreadas novedosas serían 45 útiles como marcas de propiedad para plantas. Modificaciones adicionales a flavonoides comunes a bayas o frutos que incluyen uvas y manzanas y sus zumos, incluyendo el vino, tendrían la posibilidad de conferir características de estilo alteradas de valor a tales industrias de los frutos y de subproductos.

El color de las flores es predominantemente debido a tres tipos de pigmento: flavonoides, carotenoides y betalaínas. De los tres, los flavonoides son los más comunes y contribuyen a una amplia gama de colores desde el amarillo hasta el rojo y hasta el azul. Las moléculas de flavonoides que hacen la principal contribución al color de las flores son las antocianinas, que son derivados glucosilados de cianidina y su derivado metilado peonidina, moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina y sus derivados metilados petunidina y malvidina y pelargonidina. Las antocianinas están localizadas en la vacuola de las células epidérmicas de los pétalos o en la vacuola de las células 55 subepidérmicas de las hojas.

Los pigmentos flavonoides son metabolitos secundarios de la ruta fenilpropanoide. La ruta biosintética de los pigmentos flavonoides (ruta de los flavonoides) está bien establecida (Holton y Cornish, Plant Cell 7: 1071-1083, 1995; Mol y col., Trends Plant Sci. 3: 212-217, 1998; Winkel-Shirley, Plant Physiol. 126: 485-493, 2001a; y Winkel-Shirley, Plant Physiol. 127: 1399-1404, 2001b) y se muestra en las Figuras 1A y B. Tres reacciones y enzimas participan en la conversión de la fenilalanina a p-cumaroil-CoA, uno de los primeros sustratos clave en la ruta de los flavonoides. Las enzimas son fenilalanina amonio-liasa (PAL) , cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y 4-cumarato: CoA ligasa (4CL) . La primera etapa comprometida en la ruta implica la condensación de tres moléculas de malonil-CoA (proporcionada por la acción de la acetil COA carboxilasa (ACC) sobre acetil CoA y CO2) con una molécula de p65 cumaroil-CoA. Esta reacción es catalizada por la enzima chalcona sintasa (CHS) . El producto de esta relación, la 2', 4, 4', 6'-tetrahidroxi-chalcona, normalmente se isomeriza de manera muy rápida por la enzima chalcona flavanona isomerasa (CHI) para producir naringenina. La naringenina se hidroxila posteriormente en la posición 3 del anillo central por la flavanona 3-hidroxilasa (F3H) para producir dihidrocanferol (DHK) .

El patrón de hidroxilación del anillo B del dihidrocanferol (DHK) desempeña una función clave en la determinación del color de los pétalos. El anillo B puede hidroxilarse en o bien la posición 3', o en tanto las posiciones 3' como 5', para producir dihidroquercetina (DHQ) o dihidromiricetina (DHM) , respectivamente. Dos enzimas clave implicadas en esta parte de la ruta son flavonoide 3'-hidroxilasa y flavonoide 3', 5'-hidroxilasa, ambas de la clase de citocromo P450 de las enzimas. Las enzimas citocromo P450 tienen amplia distribución en la naturaleza y se han aislado y secuenciado genes a partir de vertebrados, insectos, levaduras, hongos, bacterias y plantas.

La flavonoide 3'-hidroxilasa (F3'H) es una enzima clave en la ruta de los flavonoides que conduce a los pigmentos basados en cianidina que, en muchas especies vegetales (por ejemplo, Rosa spp., Dianthus spp., Petunia spp., begonia, ciclamen, impatiens, gloria de la mañana y crisantemo) contribuyen al color rojo y rosa de las flores.

La flavonoide 3', 5'-hidroxilasa (F3'5'H) es una enzima clave en la ruta de los flavonoides que conduce a los pigmentos basados en delfinidina que, en muchas especies de plantas (por ejemplo, Petunia spp., Viola spp., Lisianthus spp., Gentiana spp., Sollya spp., Salvia spp., Clitoria spp., Kennedia spp., Campanula spp., Lavandula spp., Verbena spp., Torenia spp., Delphinium spp., Solanum spp., Cineraria spp., Vitis spp., Babiana stricta, Pinus spp., Picea spp., Larix spp., Phaseolus spp., Vaccinium spp., Cyclamen spp., Iris spp., Pelargonium sp., Liparieae, Geranium spp., Pisum spp., Lathyrus spp., Catharanthus spp., Malvia spp., Mucuna spp., Vicia spp., Saintpaulia spp., Lagerstroemia spp., bouchina spp., Plumbago spp., Hypocalyptus spp., Rhododendron spp., Linum spp., Macroptilium spp., Hibiscus spp., Hydrangea spp., Cymbidium spp., Millettia spp., Hedysarum spp., Lespedeza spp., Asparagus spp., Antigonon spp., Pisum spp., Freesia spp., Brunella spp., Clarkia spp., etc.) contribuyen al color púrpura y azul de las flores. Muchas especies tales como rosas, gerberas, crisantemos y claveles no producen pigmentos basados en delfinidina debido a que carecen de una actividad de F3'5'H.

La siguiente etapa en la ruta, que conduce a la producción de las antocianinas coloreadas a partir de los dihidroflovonoides (DHK, DHQ, DHM) implica dihidroflavonol-4-reductasa (DFR) que conduce a la producción de las leucoantocianidinas. Las leucoantocianidinas se convierten posteriormente en antocianidinas, pelargonidina, cianidina y moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina. Estas moléculas de flavonoide son inestables bajo condiciones fisiológicas normales y la glucosilación en la posición 3, mediante la acción de las glucosiltransferasas, estabiliza la molécula de antocianidina permitiendo así la acumulación de las antocianinas. En general, las glucosiltransferasas transfieren los restos azúcar de los azúcares UDP a las moléculas de flavonoide y muestran altas especificidades de la posición de glucosilación y especificidades relativamente bajas para los sustratos aceptores (Seitz y Hinderer, Anthocyanins. En:... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada para su uso como promotor que es operable en tejido de pétalo de rosa que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con al menos una de SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:30 o un complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico está seleccionada de SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:30.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 ó 2 operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una flavonoide 3', 5'-hidroxilasa (F3'5'H) , en la que la secuencia de nucleótidos está seleccionada de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con al menos una de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o un complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad, en la que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico que codifica una F3'5'H en un tejido de pétalo produce niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica.

4. Un método de producción de una planta transgénica que puede sintetizar una F3'5'H, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta con una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3, en condiciones que permitan la eventual expresión de dicha secuencia de nucleótidos, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos.

5. Un método de producción de una planta transgénica con actividad de F3'5'H reducida, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta con una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos.

6. Una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o que comprende un nivel alterado de expresión de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 con respecto al nivel de expresión en una planta no genéticamente modificada, preferentemente en la que la planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma presentan flores alteradas o inflorescencia.

7. La planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma de la reivindicación 6, en la que la parte de planta está seleccionada del grupo que comprende sépalo, bráctea, pecíolo, pedúnculo, ovario, anteras, flores, frutos, frutos secos, raíces, tallos, hojas y semillas.

8. La planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma de la reivindicación 6 ó 7, en la que la planta está seleccionada del grupo que comprende rosa, clavel, lisianthus, petunia, lirio, pensamiento, gerbera, crisantemo, geranio, Torenia, Begonia, Cyclamen, Nierembergia, Catharanthus, Pelargonium, orquídea, uva, manzana, Euphorbia y Fuchsia, preferentemente rosa.

9. El uso de una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la fabricación de: (i) una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma; o (ii) una construcción genética que puede expresar F3'5'H o regular por disminución una enzima F3'5'H indígena en una planta.

10. Una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico aislada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una función de expresión de novo, expresión en exceso, supresión de sentido, inhibición antisentido, actividad de ribozima, minizima y ADNzima, inducción de RNAi o inducción de metilación.

11. Un extracto de las flores de una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

12. Un organismo procariota o eucariota no humano que lleva una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 extracromosómicamente en forma de plásmido.

13. Uso de una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3 en la identificación o amplificación y

clonación de material genético que codifica una F3'5'H.

14. Uso de una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 ó 2 ó 3 en la identificación o amplificación y clonación de material genético que define un promotor de chalcona sintasa.