Procedimiento para pruebas preclínicas de fármacos inmunomoduladores.

Procedimiento para probar un fármaco inmunomodulador en estudio o conocido para la activación de linfocitos T,

que comprende la etapa de poner en contacto in vitro un cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con una cantidad predeterminada del fármaco inmunomodulador en estudio o conocido y observar el cultivo de PBMC para determinar la liberación de al menos una citocina de las PBMC o para determinar la proliferación celular después de ponerse en contacto con el fármaco inmunomodulador en estudio o conocido, en el que la densidad celular de un precultivo de PBMC durante y/o después de la etapa de precultivo es de al menos 2*106/ml o de al menos 4*105/cm2 de modo que se permite el contacto célula-célula de las PBMC, y en el que el precultivo de PBMC se cultiva durante al menos 12 h.

Procedimiento para pruebas preclínicas de fármacos inmunomoduladores Campo de la invención La invención se refiere a un procedimiento en el que se prueba un fármaco inmunomodulador conocido o en estudio, que comprende la etapa de poner en contacto un cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con el fármaco inmunomodulador y observar el cultivo de PBMC para determinar la liberación de al menos una citocina de las PBMC o para determinar la proliferación celular después de ponerse en contacto con el fármaco inmunomodulador. La invención se refiere además a un procedimiento de prueba de fármacos de atenuación de la tormenta de citocinas in vitro. Finalmente, la invención se refiere a un procedimiento.

Estado de la técnica y antecedentes de la invención Los fármacos inmunoterápicos que modulan la actividad de los linfocitos se evalúan preclínicamente en dos sistemas: Modelos animales, normalmente roedores, y, si es posible, en primates; y cultivos de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) .

Las PBMC se usan de forma rutinaria porque, en primer lugar, contienen todos los subconjuntos de linfocitos así como de monocitos, y en segundo lugar, están fácilmente disponibles de la extracción de sangre venosa de donantes sanos o de pacientes. La estimulación in vitro de estas PBMC se considera un indicador útil de las actividades que se esperan de un fármaco inmunomodulador in vivo.

Determinados agentes de activación de linfocitos T, en particular anticuerpos monoclonales (mAb) que dirigen el receptor de antígeno de linfocitos T (TCR) tal como OKT3, el primer mAb usado en medicina para la inmunosupresión, inducen la liberación sistémica de citocinas proinflamatorias (Abramowicz et al., 1989) . Los más peligrosos de éstos son TNF, interferón-gamma (IFN-gamma) e IL-2. En pacientes que reciben tratamientos de mAb,

se logra de forma rutinaria el control de un síndrome de liberación de citocinas de este tipo o “tormenta de citocinas”

por tratamiento corticoesteroideo de dosis alta.

El TGN1412 es un anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) de la subclase de IgG4 específico para la molécula coestimuladora CD28 expresada por linfocitos T humanos. Se denomina “superagonista de CD28” (CD28SA) porque a diferencia del mAb específico de CD28, puede activar linfocitos T sin un acoplamiento simultáneo del receptor de antígeno de linfocitos T (TCR) (Hunig, 2007) . El TGN1412 se desarrolló por el ya desaparecido TeGenero AG, Würzburg.

Durante un primer ensayo clínico en el ser humano llevado a cabo por la unidad de ensayos clínicos independiente Parexel en el Northwick Park Hospital, Londres, el 13 de marzo de 2006, la aplicación intravenosa de 100 μ/kg de peso corporal de TGN1412 a voluntarios humanos sanos da lugar a un síndrome de liberación de citocinas potencialmente mortal que sólo de controló después del traslado de los voluntarios a la unidad de cuidados intensivos del hospital (Suntharalingam et al., 2006) .

El trabajo preclínico presentado por el patrocinador, TeGenero AG, no mostró pruebas de una “tormenta de citocinas” de este tipo en un modelo de ratón análogo usando un superagonista específico de CD28 de rata, ni en macacos de Java que recibieron el propio TGN1412 a dosis hasta 50 veces mayores que las de los voluntarios humanos (Duff, 2006) . Además, la adición de TGN1412 a cultivos de PBMC humanas tampoco dio como resultado la liberación de citocinas. Se repitieron todos los experimentos con monos clave y cultivos de PBMC por el British National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) actuando en nombre del Expert Scientific Group on Phase One Clinical Trials del gobierno, y confirmaron el comportamiento inocuo de TGN1412 en estos sistemas (Duff, 2006) . Tres años después del ensayo fallido de TNG1412, aún no se ha aclarado por qué este ensayo in vitro no previno contra la tormenta de citocinas experimentada por los voluntarios humanos.

La ineficacia de los roedores y macacos de Java en la liberación de citocinas sistémicas tóxicas después de la inyección de CD28SA obviamente es debido a diferencias entre especies en la reactividad del sistema inmunitario intacto de dichos agentes, y se han realizado sugerencias específicas para dichas diferencias. (Gogishvili et al., 2009; Nguyen et al., 2006; Schraven y Kalinke, 2008) .

Estos hallazgos indican que debido a patrones de reacción específicos de especies, incluso los modelos animales de primates no siempre son predictores seguros de la reactividad humana de fármacos novedosos.

Cabe destacar que un ser humano tiene aproximadamente 1012 linfocitos T, y que menos de un uno por ciento de estos están circulando en la sangre en cualquier momento dado. Por lo tanto, la ineficacia de las PBMC cultivadas en la respuesta a TGN1412 se debe a un defecto funcional en estas células en comparación con las que residen en los tejidos linfoides (que obviamente respondieron con la liberación de citocinas en los voluntarios) , o bien al requisito de un tipo celular presente en órganos linfoides pero no en la sangre para la activación mediada por TGN1412 de los linfocitos T.

Por lo tanto, la reproducción de la tormenta de citocinas observada en los voluntarios humanos del ensayo de TGN1412 en Londres en el cultivo celular se necesita con urgencia para entender su mecanismo y para probar su sensibilidad a la inhibición farmacológica.

Desde un punto de vista más amplio, la ineficacia de los cultivos conocidos de PBMC humanas en la respuesta a TGN1412 soluble con una liberación de citocinas indica que este sistema no responde a todos los agentes de activación de linfocitos de la misma forma en que lo hace el sistema inmunitario humano intacto dentro del cuerpo. La corrección de este defecto no sólo puede permitir un análisis detallado de los efectos de superagonistas (SA) de CD28 humanos tales como TGN1412, sino que también revela la reactividad de otros fármacos aparentemente inocuos durante el desarrollo preclínico.

Problema técnico de la invención El problema técnico de la invención es, en consecuencia, proporcionar medios mejorados para pruebas in vitro de fármacos inmunomoduladores, en particular CD28SA, con respecto a posibles tormentas de citocinas. Otro objetivo de la invención es proporcionar medios para probar fármacos adecuados para atenuar tormentas de citocinas.

Principios de la invención y realizaciones preferidas Para resolver el problema técnico mencionado en primer lugar, la invención enseña un procedimiento para probar un fármaco inmunomodulador en estudio o conocido para la activación de linfocitos T, que comprende la etapa de poner en contacto in vitro un cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con una cantidad predeterminada del fármaco inmunomodulador en estudio o conocido y observar el cultivo de PBMC para determinar la liberación de al menos una citocina de las PBMC después de ponerse en contacto con el fármaco inmunomodulador en estudio o conocido, en el que se ajusta la densidad celular de un precultivo de PBMC de modo que se permite el contacto célula-célula de las PBMC y en el que se cultiva el precultivo durante al menos 12 h. El término "precultivado" quiere decir que el cultivo de PBMC se cultiva en ausencia de fármacos inmunomoduladores y antes de ponerse en contacto con dichos fármacos que se van a probar. El término "observar" comprende la medida cualitativa, semicuantitativa y cuantitativa de concentraciones de la al menos una citocina o de la proliferación con procedimientos conocidos en la técnica.

La invención se basa en el hallazgo sorprendente de que un cultivo de PBMC, que se prepara por procedimientos convencionales, pero que se precultiva adicionalmente durante un periodo de tiempo predeterminado antes de ponerse en contacto con el fármaco inmunomodulador, muestra de repente sensibilidad con respecto a la liberación de citocinas desencadenada por el contacto con fármacos inmunomoduladores, que no desencadenan la liberación de citocinas en ausencia del procedimiento de precultivo. La invención se basa además en el hallazgo de que este efecto de precultivo está promovido por contactos célula-célula de las PBMC durante un periodo de tiempo predeterminado. Dicho de otro modo, el cultivo de PBMC no debe estar recién preparado cuando se añade el fármaco inmunomodulador.

Por lo tanto, la invención es útil para predecir la reactividad de individuos a fármacos inmunomoduladores, como TGN1412, y, como se explicará después con más detalle, la capacidad de fármacos inmunodepresores tales como corticoesteroides para controlar reacciones no deseadas. También es útil entender además el... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para probar un fármaco inmunomodulador en estudio o conocido para la activación de linfocitos T, que comprende la etapa de poner en contacto in vitro un cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con una cantidad predeterminada del fármaco inmunomodulador en estudio o conocido y observar el cultivo de PBMC para determinar la liberación de al menos una citocina de las PBMC o para determinar la proliferación celular después de ponerse en contacto con el fármaco inmunomodulador en estudio o conocido, en el que la densidad celular de un precultivo de PBMC durante y/o después de la etapa de precultivo es de al menos 2*106/ml o de al menos 4*105/cm2 de modo que se permite el contacto célula-célula de las PBMC, y en el que el precultivo de PBMC se cultiva durante al menos 12 h.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de precultivo se lleva a cabo almacenando el cultivo de PBMC durante al menos 24 h, preferentemente al menos 36 h, más preferentemente al menos 45 h, de 35 ºC a 40 ºC en ausencia de fármacos inmunomoduladores antes del contacto con el fármaco inmunomodulador que se va a probar.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el fármaco inmunomodulador es un fármaco inmunoestimulante.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el fármaco inmunoestimulante es un anticuerpo.

5. El procedimiento de la reivindicación 4 en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal superagonista específico de CD28 humano.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la citocina observada se selecciona del grupo que consiste en TNF, IFN-gamma, IL-1-beta, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL9, IL-10, IL12p70, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL- 21, IL-35, LT y combinaciones de las mismas.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cultivo de PBMC precultivadas se pone en contacto adicionalmente con un fármaco en estudio para atenuar la liberación de al menos una citocina, mientras se pone en contacto al mismo tiempo el cultivo de PBMC con el fármaco inmunomodulador, en particular estimulante, conocido o posteriormente después de un periodo de tiempo predeterminado, o un periodo de tiempo predeterminado antes, en el que se observa adicionalmente liberación de citocinas.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el periodo de tiempo predeterminado puede estar en el intervalo de 10 s a 12 h, preferentemente en el intervalo de 10 s a 1 h.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en el que el fármaco en estudio para atenuar la liberación de citocinas es un corticoesteroide.