Producto y procedimiento de inmunoensayo.

Un dispositivo para llevar a cabo inmunoensayos que comprende un soporte poroso (4) para soportar una o máscapas de membrana de transferencia y,

un distribuidor de flujo poroso (12) que es hidrófilo y tiene bajascaracterísticas de unión a proteínas para posibilitar una distribución uniforme de líquido a través de su cara colocadaencima del soporte poroso, y dichas membranas de transferencia caracterizadas por uno o más pocillos de reactivo(14) montados encima del distribuidor de flujo.

Producto y procedimiento de inmunoensayo Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/795.452, presentada el 27 de abril de 2006 y la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/732.994, presentada el 3 de noviembre de 2005.

La invención se refiere a un dispositivo de laboratorio y a un procedimiento de uso del dispositivo para detectar la posición de o presencia/ausencia de sustancias que están contenidas en una membrana de transferencia. Más particularmente, la presente invención se refiere a una técnica para aplicar reactivos y soluciones de lavado a una membrana de transferencia para conseguir esta detección rápidamente mediante el uso de un vacío o una presión positiva.

Antecedentes de la invención El uso de electroforesis en gel es actualmente la técnica más extendida para la separación de materiales biológicos. (Los materiales no biológicos también pueden separarse usando geles u otros soportes cromáticos también, pero el alcance de esfuerzo con respecto a los biológicos es mayor.) Las aplicaciones típicas incluyen la separación de fragmentos de ácido nucleico de diversos tamaños en el contexto de determinación de la secuencia; en la detección de polimorfismos; o verificación de tamaños en otros contextos. También se realizan frecuentemente separaciones de proteínas y glucoproteínas y la aplicación de separaciones en gel como verificación de homogeneidad o pureza.

En todos estos procedimientos, se aplican muestras mixtas de entidades biológicas a geles electroforéticos y los componentes se separan mediante la aplicación de un campo eléctrico a través del gel. Independientemente de la manera en la que se desarrolla el gel, el patrón de migración resultante de las sustancias contenidas en la muestra debe ser detectado de alguna manera.

Para realizar esta detección, típicamente el soporte de gel se pone en contacto con una membrana de transferencia a la que son transferidas las sustancias en el mismo patrón en el que aparecían en el gel. Las “manchas” son detectadas a continuación, a un mínimo, bloqueando la membrana con una solución de proteína o detergente para reducir la unión no específica (que, en caso contrario, conduce a un alto nivel de ruido y un bajo nivel de detección) . Los agentes de bloqueo típicos incluyen caseína, albúmina de suero bovino (BSA) , leche en polvo desnatada (generalmente a aproximadamente al 1%) en una solución de TBS-T o PBS-T. La entidad biológica es incubada a continuación con un anticuerpo específico para el antígeno en la membrana. La membrana se lava a continuación exhaustivamente para retirar cualquier contaminante (tal como restos de gel) , proteínas de bloqueo o anticuerpos no unidos y similares. La membrana es tratada e incubada a continuación con un anticuerpo secundario conjugado a una enzima, un radioisótopo, flúor-flúor o biotina, específico para el anticuerpo primario. La membrana se lava de nuevo exhaustivamente para retirar cualquier anticuerpo secundario no unido. A continuación, se aplica un reactivo detector, generalmente un material cromógeno, quimioluminiscente, fluorescente, radiológico o marcado con estreptavidina, que se une a, o es un sustrato de, la enzima-conjugado. Finalmente, se usa el dispositivo de detección apropiado para determinar la presencia, ausencia, posición, cantidad, etc., de la entidad biológica. Las últimas seis etapas generalmente requieren de 3-6 horas a una noche dependiendo de la velocidad de la reacción entre los reactivos seleccionados, la membrana y la entidad biológica y el procedimiento requiere múltiples periodos de incubación de la membrana en una plataforma con agitación. Es un procedimiento tedioso que desagrada a la mayoría de los investigadores y que consume (malgasta) un gran volumen de reactivos.

El documento WO 2004013607 describe apilamientos de membranas que absorben biomoléculas. El documento WO 20050033346 desvela una distribución de flujo por debajo de las membranas.

Algunos investigadores han sugerido el uso de la acción de capilaridad de un material absorbente tal como papel de filtro colocado debajo de la membrana para arrastrar a los fluidos restantes a través de la membrana y mejorar la velocidad del procedimiento, especialmente las etapas de lavado.

El documento US 5.155.049 menciona un sistema llamado la cámara de hibridación Hybrid-Ease™ comercializado por Hoefer Scientific Instruments. Esta cámara comprende dos rejillas entre las cuales está intercalada la membrana. Las placas de la rejilla se encajan en posición rodeando a la membrana, y se instalan jeringas en el espacio abierto creado por las rejillas. Una jeringa se usa para aplicar reactivos y lavar, y la otra para retirar el exceso. El sistema requiere grandes volúmenes de líquido para funcionar, es engorroso de emplear y sigue requiriendo bastante tiempo. El documento también menciona que, en algunos ensayos particulares, tales como ensayos ELISA, en pocillos de pequeño volumen (tal como una placa de microvaloración de 96 pocillos) , otros han usado vacío para arrastrar líquidos a través de una o más membranas en una etapa de lavado. Sin embargo, no tienen en cuenta este esfuerzo, ya que solamente está disponible en aplicaciones de pequeño volumen y sigue siendo incontrolable. En su lugar, sugieren que el mejor procedimiento es usar una prensa manual que tiene la membrana encima de un papel de filtro y una capa de cubierta y a continuación prensar la membrana intercalada entre dos placas para exprimir el líquido a través de la membrana y al papel.

Queda claro que se requiere un procedimiento más eficiente para la detección de los materiales o entidades biológicas en membranas de transferencia. La presente invención permite una detección más efectiva y eficiente de entidades biológicas en una membrana de transferencia.

Resumen de la invención La presente invención solamente está limitada por sus reivindicaciones.

Se proporciona un procedimiento rápido, eficiente y conveniente para detectar una o más entidades biológicas en una membrana de transferencia. La detección puede referirse a la posición, naturaleza o cantidad de la sustancia biológica en una o más membranas. El procedimiento de la invención implica un régimen asistido por presión, seleccionado entre un régimen asistido por presión positiva o vacío para el suministro y la retirada de reactivos y permite el lavado de los contaminantes de sustancias incluidas en la membrana a detectar usando volúmenes muy bajos de líquido. Este procedimiento permite completar las etapas de bloqueo, lavado y unión al anticuerpo en aproximadamente 30-45 minutos sin comprometer la calidad de la transferencia.

De este modo, en un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para hacer pasar líquido, tal como una solución de anticuerpo, reactivo de detección o lavado, a través de una o más membranas en las que están embebidas una o más sustancias biológicas a detectar. La membrana puede corresponder, por ejemplo, al patrón de migración de una muestra sometida a separación en un gel de electroforesis. La membrana también puede ser un soporte sólido de un ensayo de unión específica.

Este procedimiento es particularmente útil para membranas que se obtienen mediante transferencia de un soporte de gel que ha sido usado para separación electroforética de materiales contenidos en una muestra o verificación de pureza.

En otro aspecto, la invención se refiere a un aparato útil para llevar a cabo el procedimiento de la invención. El dispositivo está constituido por varias capas que incluyen una capa de soporte porosa por debajo de las una o más capas de membrana de transferencia, un distribuidor de flujo por encima de la membrana o membranas de transferencia y un pocillo en el distribuidor de flujo para contener el líquido en el área deseada y para permitir volúmenes de partida más bajos de dicho líquido. Preferiblemente, el distribuidor de flujo es una membrana porosa no de unión o de baja unión, tal como una membrana de 0, 22 micrómetros.

El dispositivo tiene una o más membranas de transferencia montadas entre el distribuidor de flujo y el soporte y se coloca a continuación sobre o en el interior de un colector de vacío de dimensiones adecuadas o una cámara de presión está instalada sobre la parte superior del distribuidor de flujo. El procedimiento se realiza a continuación con el uso de vacío o presión positiva entre las etapas necesarias para mover el líquido a través de la membrana.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un dispositivo para llevar a cabo inmunoensayos asistidos por vacío que... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo para llevar a cabo inmunoensayos que comprende un soporte poroso (4) para soportar una o más capas de membrana de transferencia y, un distribuidor de flujo poroso (12) que es hidrófilo y tiene bajas características de unión a proteínas para posibilitar una distribución uniforme de líquido a través de su cara colocada encima del soporte poroso, y dichas membranas de transferencia caracterizadas por uno o más pocillos de reactivo (14) montados encima del distribuidor de flujo.

2. El dispositivo de la reivindicación 1:

i) en el que el distribuidor de flujo y los uno o más pocillos de reactivo son una unidad integral, o ii) en el que el distribuidor de flujo es una membrana y el distribuidor de flujo y uno o más pocillos de reactivo son una unidad integral, o iii) que comprende, además, una bandeja de recogida debajo del soporte para la recuperación de reactivos, o iv) que comprende, además, una bandeja de recogida debajo del soporte para la recuperación de reactivos y en el que la bandeja se subdivide en dos o más sub-bandejas diferentes.

3. El dispositivo de la reivindicación 1, para llevar a cabo inmunoensayos asistidos por vacío, comprendiendo, además, el dispositivo un colector de vacío (8) .

4. El dispositivo de la reivindicación 1, adaptado para llevar a cabo inmunoensayos asistidos por vacío, que comprende, además, una o más membranas (10) que contienen una o más entidades biológicas a ensayar, estando las una o más membranas montadas encima del soporte poroso, estando el distribuidor de flujo encima de las una o más membranas.

5. El dispositivo de la reivindicación 1, adaptado para llevar a cabo inmunoensayos asistidos por presión que comprende, además, un colector de recogida (22) , una o más membranas (10) que contienen una o más entidades biológicas a ensayar, estando las una o más membranas ubicadas encima del soporte poroso, estando el distribuidor de flujo colocado encima de las una o más membranas, y un tapón de presión (13) sellado de forma que pueda desmontarse encima de los uno o más pocillos de reactivo, teniendo el tapón una entrada (15) a su interior, estando la entrada conectada a una fuente de presión gaseosa positiva.

6. El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende una pluralidad de dichos pocillos de reactivo, en el que cada pocillo tiene su propio distribuidor de flujo.

7. Un procedimiento para llevar a cabo inmunoensayos asistidos por vacío, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un colector de vacío (8) , un soporte poroso (4) colocado sobre el colector de vacío, una o más membranas (10) que contienen una o más entidades biológicas a ensayar, estando las una o más membranas colocadas sobre el soporte poroso, y un distribuidor de flujo poroso (12) que es hidrófilo y tiene bajas características de unión a proteínas de acuerdo con la reivindicación 1 para posibilitar una distribución uniforme de líquido a través de su cara colocada de las una o más membranas, caracterizado por que uno o más pocillos (14) están colocados encima del distribuidor de flujo, b) uno o más reactivos se añaden a los uno o más pocillos y se aplica un vacío para arrastrar a los reactivos al interior de las una o más membranas, y c) uno o más agentes de lavado se añaden a los uno o más pocillos y se aplica un vacío para arrastrar a los agentes de lavado y cualesquiera reactivos no unidos a través del distribuidor de flujo, una o más membranas y soporte poroso y al interior del colector de vacío.

8. El procedimiento de la reivindicación 7:

i) en el que las etapas (b) y (c) se repiten una o más veces, o ii) que comprende, además, una etapa (d) de detectar las una o más entidades biológicas, o iii) que comprende, además, una etapa (d) de detectar las una o más entidades biológicas mediante un mecanismo de detección seleccionado entre el grupo constituido por entidades radiológicas y entidades colorimétricas, o iv) en el que, en la etapa (b) , el reactivo es un anticuerpo y se le permite incubar sobre/en las una o más membranas de transferencia sin aplicar el vacío durante un periodo de tiempo establecido.

9. Un procedimiento de hacer pasar a un líquido de lavado o que contiene un reactivo a través de una o más membranas de transferencia que contienen una o más entidades biológicas, de las cuales al menos una debe ser detectada, en el que el procedimiento comprende:

a) proporcionar un colector de vacío (8) , un soporte poroso (4) colocado sobre el colector de vacío y, un distribuidor de flujo poroso (12) que es hidrófilo y tiene bajas características de unión a proteínas para posibilitar una distribución uniforme de líquido a través de su cara caracterizado por que uno o más pocillos (14) están colocados encima del distribuidor de flujo, b) las una o más membranas de transferencia (10) que contienen las una o más entidades biológicas están colocadas sobre el soporte poroso, c) el distribuidor de flujo está colocado encima de las una o más membranas de transferencia, se añade un líquido al pocillo del distribuidor de flujo, y

d) se aplica un vacío para arrastrar al líquido a través de las una o más membranas de transferencia.

10. Un procedimiento de hacer pasar a un líquido de lavado o que contiene un reactivo a través de una membrana de transferencia que contiene una o más entidades biológicas, de las cuales al menos una debe ser detectada, en el que el procedimiento comprende:

a) proporcionar un dispositivo constituido por un colector de recogida (22) , un soporte poroso (4) , un distribuidor

de flujo poroso (12) que es hidrófilo y tiene bajas características de unión a proteínas de acuerdo con la reivindicación 1 para posibilitar la distribución uniforme de líquido a través de su cara colocada encima del soporte, caracterizado por que uno o más pocillos (14) están colocados encima del distribuidor de flujo y un tapón de presión (13) está unido de forma que pueda desmontarse a la parte superior de los uno o más pocillos, teniendo el tapón una entrada (15) a su interior, entrada que está conectada a un suministro de presión gaseosa positiva, b) una o más capas de membrana de transferencia (10) que contienen las una o más entidades biológicas están colocadas sobre el soporte poroso, c) el distribuidor de flujo está colocado encima de las una o más capas de membrana de transferencia, se añade un líquido a los uno o más pocillos del distribuidor de flujo, y

d) se aplica una presión positiva a través de la entrada al tapón para mover el líquido desde los pocillos a través de las una o más capas de membrana de transferencia y al interior del colector.

11. El procedimiento de la reivindicación 7, 9 ó 10, en el que se proporciona una pluralidad de dichos pocillos de reactivo, teniendo cada pocillo su propio distribuidor de flujo.