Producción de isoprenoides.

Un procedimiento para la producción de isoprenoides, que comprende

a.

introducir en un microorganismo seleccionado del género Rhodobacter una secuencia de ADN que codificauna enzima que tiene actividad de decaprenil difosfato sintasa y una secuencia de polinucleótidos quecomprende genes del operón mev de acuerdo con SEQ ID NO: 23,

b. cultivar el microorganismo de la etapa (a) bajo condiciones que permiten la producción de isoprenoides.

Producción de isoprenoides La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de isoprenoides, en particular coenzima Q10, por parte de microorganismos. Más particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción incrementada de coenzima Q-10 por parte de microorganismos del género Rhodobacter, preferiblemente de la especie R. sphaeroides, que han sido transformados con uno o más genes del operón mevalonato (mev) procedente de un microorganismo diferente, preferiblemente del género Paracoccus, más preferiblemente de la especie P. zeaxanthinifaciens, en donde el operón mev está mutado, conduciendo a una producción incrementada de coenzima Q-10. También se incluyen secuencias que portan una mutación de este tipo, así como un microorganismo que porta un operón mev mutado de este tipo.

Coenzima Q-10 (2, 3-dimetoxi-dimetil-6-decaprenil-1, 4-benzoquinona) , también conocida como ubiquinona-10, es una benzoquinona soluble en lípidos con una cadena lateral de isoprenoide compuesta por diez unidades de isoprenoide C-5. La coenzima Q-10 (abreviada aquí en lo que sigue como CoQ10) se encuentra en microorganismos y plantas, así como en animales. Es la forma más frecuente de ubiquinona en seres humanos y en la mayoría de los mamíferos. Se establece y existe una evidencia creciente de que CoQ10 es un factor importante en el estado de salud de seres humanos y de su protección frente a enfermedades. Los efectos beneficiosos médicos y de salud de CoQ10 han sido asociados con sus dos funciones fisiológicas principales, a saber el funcionar como un cofactor esencial de la cadena de transporte mitocondrial de electrones (que está acoplada a la síntesis de adenosina trifosfato) y de actuar como un antioxidante soluble en lípidos.

Los beneficios de salud de CoQ10 han conducido a una importancia comercial incrementada de este compuesto. CoQ10 se puede producir por síntesis química o mediante fermentación utilizando microorganismos. Estos microorganismos pueden ser productores naturales de CoQ10 que han sido mejorados para la producción de CoQ10 mediante ingeniería genética, o pueden no producir de forma natural CoQ10, sino haber sido manipulados mediante ingeniería genética para ser capaces de sintetizarla.

En bacterias, el anillo quinoide de ubiquinonas se deriva de corismato, un compuesto intermedio principal en la biosíntesis de compuestos aromáticos, mientras que la cola isoprenoide de ubiquinonas se deriva del compuesto C-5 pirofosfato de isopentenilo (IPP – siglas en inglés) . La longitud de la cola isoprenoide añadida al anillo quinoide depende de la enzima preniltransferasa particular que existe en la bacteria. Por ejemplo, en Escherichia coli, la octaprenil pirofosfato sintasa cataliza la formación de pirofosfato de octaprenilo (C-40) a partir de pirofosfato de farnesilo (FPP – siglas en inglés, C-15) y cinco unidades IPP. La adición de esta molécula al anillo quinoide resulta en la formación de ubiquinona-8. En especies de Paracoccus y Rhodobacter, la decaprenil pirofosfato (DPP- siglas en inglés) sintasa cataliza la formación de DPP (C-50) a partir de FPP (C-15) y siete unidades IPP. La adición de DPP al anillo quinoide resulta entonces en la formación de ubiquinona-10 (CoQ10) .

En la naturaleza se conocen dos vías diferentes para la biosíntesis de IPP (Figura 1) . La vía del mevalonato, como su nombre implica, utiliza mevalonato como compuesto intermedio principal y ha sido bien estudiada en eucariotas. Se pensó durante muchos años que la vía del mevalonato era la vía universal de la síntesis de IPP en la naturaleza. Sin embargo, en la última década se descubrió una segunda vía de la biosíntesis de IPP, la denominada vía del no mevalonato o la vía MEF (ya que tiene 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato como un compuesto intermedio) . La vía del MEF ha demostrado hasta ahora existir en muchas eubacterias y en el compartimiento plástido de plantas superiores.

En base a la presencia en R. spheroides del gen yaeM (ahora denominado ispC) que codifica 1-desoxi-Dxilulosa-5-fosfato reductoisomerasa, y la tras la inspección de la secuencia del genoma casi completada de R. sphaeroides, parece que esta bacteria utiliza exclusivamente la vía del MEF para la biosíntesis de iPP. Una evidencia adicional que sustenta el uso exclusivo de la vía del MEF en R. sphaeroides es el hallazgo de que una especie estrechamente relacionada, Rhodobacter capsulatus, utiliza sólo la vía del MEF para la biosíntesis de isoprenoides.

El documento WO 02/26933 A1 describe métodos para aumentar la producción de CoQ10 en Rhodobacter sphaeroides, sobre-expresando unos pocos genes nativos y/o heterólogos que codifican algunas de las enzimas de la vía del MEF. Sin embargo, la sobre-expresión de estos genes resultó en sólo una mejora muy modesta en la producción de CoQ10.

Tal como se ha mencionado arriba, algunas bacterias utilizan solamente la vía del mevalonato para la biosíntesis de IPP. Paracoccus zeaxanthinifaciens es un ejemplo de una bacteria de este tipo. En P. zeaxanthinifaciens, los genes que codifican las cinco enzimas de la vía del mevalonato, más el gen que codifica la IPP isomerasa (véase la Figura 1) están formando racimos juntos en una sola unidad de transcripción en el cromosoma, es decir, un operón denominado aquí en lo que sigue el operón mevalonato (mev) (Hümbelin et al., Gene 297, 129-139, 2002) .

Se ha encontrado ahora que la producción de isoprenoides, en particular CoQ10 puede aumentarse significativamente mediante la introducción de un operón mev mutado en un microorganismo que es por naturaleza deficiente en uno o más genes del operón mev, es decir, que utiliza de forma natural la vía del no mevalonato para la producción de isoprenoides, en donde se puede introducir el operón mev completo o uno o más genes de dicho operón mev que comprenden una o más mutaciones. La una o más mutaciones pueden ser, por ejemplo, en uno o en la totalidad de los siguientes genes: mvaA que codifica hidroximetilglutaril-CoA reductasa, idi que codifica isopentenil difosfato isomerasa, hcs que codifica hidroximetilglutaril-CoA sintasa, mvk que codifica mevalonato quinasa, pmk que codifica fosfomevalonato quinasa y mvd que codifica difosfomevalonato descarboxilasa.

Además de ello, se ha encontrado que la producción de isoprenoides, en particular CoQ10 puede ser adicionalmente incrementada mediante la introducción de una secuencia de ADN que codifica una proteína con una actividad de decaprenil difosfato sintasa en dicho microorganismo recombinante.

Así, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de isoprenoides de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas: a. Introducir en un microorganismo seleccionado del género Rhodobacter una secuencia de ADN que codifica una enzima con actividad de decaprenil difosfato sintasa y una secuencia de polinucleótidos que comprende genes del operón mev de acuerdo con SEQ ID NO: 23, b. cultivar el microorganismo de la etapa (a) bajo condiciones que permitan la producción de isoprenoides.

La mejora en la producción de isoprenoides se puede medir, por ejemplo, mediante una comparación de la producción en un microorganismo de tipo salvaje que no porta dichas secuencias de polinucleótidos, es decir, no utilizando la vía del mev, con el microorganismo que porta una secuencia de polinucleótidos tal como de la presente invención.

En una realización, la presente invención está dirigida a una secuencia de polinucleótidos que se puede obtener de SEQ ID NO: 1 ó 2, es decir, que comprende genes del operón mev de tipo salvaje, o un fragmento del mismo, en donde el fragmento tiene la actividad de al menos uno de los genes del operón mev, p. ej., mvaA que codifica hidroximetilglutaril-CoA reductasa, idi que codifica isopentenil difosfato isomerasa, hcs que codifica hidroximetilglutaril-CoA sintasa, mvk que codifica mevalonato quinasa, pmk que codifica fosfomevalonato quinasa y mvd que codifica difosfomevalonato descarboxilasa. Preferiblemente, la secuencia de polinucleótidos mutada se representa por SEQ ID NO: 23 o un fragmento de la misma, que conduce a un incremento, p. ej., en la producción de CoQ10 cuando está presente en un microorganismo.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de ADN que comprende un operón mev que porta una mutación, estando representada dicha secuencia de ADN por SEQ ID NO:23.

La expresión “producción mejorada de isoprenoides”, en particular producción mejorada de CoQ10, tal como se utiliza en esta memoria, significa un incremento de al menos aproximadamente 10% obtenido mediante un microorganismo que porta un polinucleótido que comprende... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la producción de isoprenoides, que comprende a. introducir en un microorganismo seleccionado del género Rhodobacter una secuencia de ADN que codifica una enzima que tiene actividad de decaprenil difosfato sintasa y una secuencia de polinucleótidos que comprende genes del operón mev de acuerdo con SEQ ID NO: 23,

b. cultivar el microorganismo de la etapa (a) bajo condiciones que permiten la producción de isoprenoides.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de ADN que codifica una enzima con 10 actividad de decaprenil difosfato sintasa se representa por SEQ ID NO: 7.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el microorganismo en el que se introduce el polinucleótido es Rhodobacter sphaeroides.