Procedimiento de producción de fantasmas bacterianos (BG) utilizando beta-propiolactona (BPL) para la inactivación final.

Un método para producir una preparación de fantasma bacteriano, que comprende tratar dichos fantasmasbacterianos con beta-propiolactona.

Procedimiento de producción de fantasmas bacterianos (BG) utilizando beta-propiolactona (BPL) para la inactivación final

La invención se refiere a la preparación de fantasmas bacterianos utilizando beta-propiolactona para la inactivación final de bacterias.

Envolturas de las células bacterianas vacías de bacterias gram-negativas, los denominados fantasmas bacterianos (BG – siglas en inglés) , se preparan mediante expresión heteróloga controlada de un gen que efectúa una lisis parcial de las bacterias, particularmente bacterias gram-negativas (documentos EP-A-0 291 021, EP-A-0 516 655) . Por ejemplo, el gen lítico puede ser el gen E del bacteriófago phiX174 que codifica un polipéptido que se inserta en el complejo de la envoltura de la célula de bacterias gram-negativas y conduce a la formación de una estructura de túnel en la transmembrana a través de las membranas interna y externa. El diámetro interno de esta estructura de túnel está en el intervalo de aproximadamente 20-400 nm, particularmente 40-200 nm o 500-1.000 nm, dependiendo de las condiciones empleadas de la lisis. Los componentes citoplásmicos se liberan por medio de esta estructura de túnel, en donde se obtiene un complejo de envoltura de la célula vacía que tiene una morfología intacta, un así denominado fantasma bacteriano.

A pesar de que el proceso lítico que conduce a un BG sin contenido citoplásmico es bastante eficaz, una determinada cantidad, habitualmente aproximadamente una célula en 104 células, permanece intacta. La coexpresión regulada de un gen de la lisis bacteriana, p. ej. el gen E del bacteriófago phiX174, y un gen nucleasa con el fin de generar fantasmas bacterianos exentos de ácidos nucleicos da como resultado un incremento sinérgico de la eficacia del proceso de exterminio y, de manera correspondiente, una reducción sustancial de células bacterianas vivas en una preparación de BG según se describe en el documento WO 03/006630.

El documento US 2.9898.435 (A) se refiere a un método de esterilizar químicamente líquidos acuosos que contienen bacterias o esporas de bacterias, caracterizado por que a dichos líquidos se añade beta-propiolactona.

El documento EP 0 460 480 A2 se refiere a un método para tratar ganado bovino y ovino para prevenir la pododermatitis séptica y la necrosis hepática, que comprende administrar al animal que está siendo tratado una bacteria Fusobacterium necrophorum, que es un aislado de Fusobacterium necrophorum inactivado con una betapropiolactona.

El uso de fantasmas bacterianos como vacunas muertas o adyuvantes y la preparación de fantasmas bacterianos recombinantes que portan proteínas heterólogas en sus estructuras de la envoltura de la célula se describe en los documentos WO 91/13555 y WO 93/01791. Los fantasmas bacterianos son, además, adecuados como soportes o vehículos fijadores de objetivo para compuestos activos, según se describe en el documento WO 00/53163.

Con el fin de hacer incluso más seguro el uso de fantasmas bacterianos como vacunas muertas, particularmente para aplicaciones en medicina humana, es necesario proporcionar preparaciones de BG desprovistas de células bacterianas vivas. Por lo tanto, el problema técnico en el que se fundamenta la presente invención era proporcionar preparaciones de BG exentas de células bacterianas vivas.

Sorprendentemente, se encontró que virtualmente todas las bacterias potencialmente no exterminadas son inactivadas cuando se utilizó un agente de esterilización como una etapa final en el proceso de producción de BG, en donde dicho agente esterilizante es beta-propiolactona (BPL) . Además, sorprendentemente, la integridad de la preparación de fantasma bacteriano se mantiene después del tratamiento con beta-propiolactona.

La fórmula química para beta-propiolactona es C3H4O2, y su peso molecular es 72, 06 g/mol. La beta-propiolactona es un líquido incoloro que es altamente soluble en agua, sus productos de degradación son compuestos inofensivos que surgen de la autodestrucción. Beta-propiolactona, en calidad de un agente esterilizante, se utiliza para vacunas, injertos de tejidos, instrumentos quirúrgicos y enzimas, de plasma sanguíneo, agua, leche y caldo nutricio, y como un desinfectante en fase de vapor en espacios cerrados. Su acción esterilizante se utiliza frente a bacterias vegetativas, hongos patológicos y virus.

Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una preparación de fantasmas bacterianos

virtualmente exenta de células bacterianas vivas, que comprende tratar dichos fantasmas bacterianos con betapropiolactona. Preferiblemente, el número de cualesquiera células bacterianas vivas remanentes en el preparado fantasma se reduce en un factor de al menos 103, más preferiblemente en 104, incluso más preferiblemente en 105 y lo más preferiblemente en 106 o incluso más.

En el método arriba descrito, la beta-propiolactona se añade preferiblemente a una concentración final de 0, 01-1% (v/v) y más preferiblemente de 0, 025-0, 5% (v/v) . La beta-propiolactona se puede añadir a la preparación en una o más etapas, p. ej. en dos etapas consecutivas, en donde las dos porciones son preferiblemente de igual cantidad, en donde la segunda porción de beta-propiolactona se añade después de aproximadamente 15-45 min, p. ej. aproximadamente a los 30 min. La adición de beta-propiolactona se produce preferiblemente en forma de un líquido. Es posible la adición en forma de un vapor o aerosol, o en otras formas.

Un aspecto preferido de la presente invención es que fantasmas bacterianos se inactivan durante 10-60 min, más preferiblemente durante 15-45 min, incluso más preferiblemente durante 25-35 min.

Además de ello, de acuerdo con la presente invención, la adición de beta-propiolactona se lleva a cabo preferiblemente a 15-55ºC, más preferiblemente a 26-50ºC, más preferiblemente a 35-45ºC, incluso más preferiblemente a 36-44ºC, y lo más preferiblemente a 38-43ºC.

La preparación de fantasma bacteriano de la presente invención se puede producir por un método, que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar células bacterianas que comprendan un gen que codifica una proteína lítica capaz de formar

una estructura de túnel en la envoltura de la célula bacteriana

(b) opcionalmente, cultivar las células bacterianas bajo condiciones en donde el gen lítico no se expresa

(c) someter la célula bacteriana a condiciones en donde el gen lítico se expresa y los componentes

citoplásmicos de las células bacterianas se liberan y

(d) obtener los fantasmas bacterianos resultantes.

Un ejemplo preferido de un gen que codifica la proteína lítica es el gen E del bacteriófago phiX174.

De manera particularmente preferida, las células bacterianas utilizadas para el método arriba descrito de la preparación de fantasma bacteriano codifican adicionalmente una enzima capaz de hidrolizar componentes citoplásmicos en la célula bacteriana, según se describe en el documento WO 03/006630. El método correspondiente de la preparación de fantasma bacteriano comprende las siguientes etapas adicionales:

(a) opcionalmente, cultivar las células bacterianas bajo condiciones en donde no se expresa el gen de la enzima

(b) someter la célula bacteriana a condiciones en donde el gen de la enzima se expresa y componentes citoplásmicos de las células bacterianas se degradan.

El gen que codifica la enzima hidrolítica es preferiblemente un gen nucleasa, en particular un gen nucleasa de Staphylococcus aureus (documento WO 03/006630) .

En una realización particularmente preferida, el gen lítico y el gen de la enzima están en enlace operativo con una secuencia del control de la expresión regulable. Más preferiblemente, el gen lítico y el gen de la enzima se encuentran cada uno en enlace operativo con una secuencia de control de la expresión regulable separada y se encuentran en uno o varios vectores. Así, la expresión de los dos genes se puede iniciar por separado, p. ej. en diferentes instantes del proceso de cultivo.

Preferiblemente, las células se cultivan bajo condiciones represoras tanto para el gen lítico como para el gen de la enzima. Después, se induce la expresión de la enzima, p. ej. cuando el gen de la enzima se encuentra bajo el control de un promotor químicamente regulable tal como el promotor lac o un derivado del mismo, añadiendo un inductor tal como IPTG. Más preferiblemente, la enzima se expresa en una forma que es al menos parcialmente inactiva y que puede ser activada en una fase posterior mediante adición al cultivo de un grupo prostético.

Luego, subsiguientemente, p. ej. después de 20 min hasta 1, 5 h,... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una preparación de fantasma bacteriano, que comprende tratar dichos fantasmas bacterianos con beta-propiolactona. .

2. El método de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a) producir una preparación de fantasma bacteriano y

(b) subsiguientemente, tratar la preparación de fantasma bacteriano con beta-propiolactona bajo condiciones

en donde se reduce el número de cualesquiera células bacterianas vivas remanentes en dicha preparación 10 de fantasma.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el número de cualesquiera células bacterianas vivas remanentes en dicha preparación de fantasma se reduce en al meno.

10. 104.

4. El método de las reivindicaciones 1-3, en el que los fantasmas bacterianos se tratan con una concentración final de beta-propiolactona de 0, 01-1% (v/v) .

5. El método de las reivindicaciones 1-4, en el que la adición de beta-propiolactona se lleva a cabo en dos etapas consecutivas.

2.

6. El método de las reivindicaciones 1-5, en el que la adición de beta-propiolactona se lleva a cabo .

2. 50ºC, y en el que los fantasmas bacterianos se inactivan durante 10-60 min.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la preparación de fantasma bacteriano se 25 obtiene:

(a) proporcionando células bacterianas que comprendan un gen que codifica una proteína lítica capaz de formar una estructura de túnel en el complejo de la envoltura de la célula bacteriana,

(b) sometiendo la célula bacteriana a condiciones en donde el gen lítico se expresa y los componentes

citoplásmicos de las células bacterianas se liberan y 30 (c) obteniendo los fantasmas bacterianos resultantes.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la preparación de fantasma bacteriano se obtiene:

(a) proporcionando células bacterianas que comprendan un gen que codifica una proteína lítica capaz de 35 formar una estructura de túnel en el complejo de la envoltura de la célula bacteriana,

(b) cultivando las células bacterianas bajo condiciones en donde el gen lítico no se expresa,

(c) sometiendo la célula bacteriana a condiciones en donde el gen lítico se expresa y los componentes citoplásmicos de las células bacterianas se liberan y

(d) obteniendo los fantasmas bacterianos resultantes.

4.

9. El método de la reivindicación 7 u 8, en el que las células bacterianas codifican adicionalmente una enzima capaz de hidrolizar componentes citoplásmicos en la célula bacteriana, que comprende la siguiente etapa: someter la célula bacteriana a condiciones en donde se expresa el gen de la enzima y se degradan los componentes citoplásmicos de las células bacterianas.

4.

10. El método de la reivindicación 7 u 8, en el que las células bacterianas codifican adicionalmente una enzima capaz de hidrolizar componentes citoplásmicos en la célula bacteriana, que comprende las siguientes etapas:

(a) opcionalmente, cultivar las células bacterianas bajo condiciones en donde no se expresa el gen de la enzima 50 (b) someter la célula bacteriana a condiciones en donde el gen de la enzima se expresa y se degradan los componentes citoplásmicos de las células bacterianas.

11. El método de la reivindicación 9 ó 10, en el que el gen que codifica la enzima hidrolítica es un gen nucleasa.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en el que el gen lítico y el gen de la enzima están en enlace operativo con una secuencia de control de la expresión regulable, en donde el gen lítico y el gen de la enzima se encuentran en uno o varios vectores.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la expresión del gen lítico y la expresión de la enzima se inducen en instantes diferentes.

14. Una composición farmacéutica que comprende una preparación de fantasma bacteriano tratada con beta5 propiolactona y un soporte, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

15. La composición de la reivindicación 14, que es una vacuna o es un adyuvante.

16. La composición de la reivindicación 15 para uso en medicina humana o para uso en medicina veterinaria. 10

17. Uso de beta-propiolactona en la fabricación de una preparación de fantasma bacteriano.