Producción de biocombustible a partir de fuentes de cultivo de tejido vegetal.

Un procedimiento para la producción de al menos un ácido graso y/o aceite de un cultivo en suspensión de célulasvegetales,

comprendiendo el procedimiento

(i) mantener un cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite a un pH inferior a 7,0,de un modo tal que las células cultivadas sintetizan y secretan al menos un ácido graso y/o aceite en el mediode cultivo celular en suspensión; y

(ii) extraer el al menos un ácido graso y/o aceite así secretado del medio del cultivo celular en suspensión.

Producción de biocombustible a partir de fuentes de cultivo de tejido vegetal.

Campo de la invención La invención se refiere a la producción de aceites vegetales, ácidos grasos y otras fuentes de biocombustibles a partir de células vegetales cultivadas en cultivo de tejido.

Introducción La mención o la descripción de un documento aparentemente publicado anteriormente en esta memoria descriptiva no debe tomarse necesariamente como un reconocimiento de que el documento forma parte del estado de la técnica, o es el conocimiento general común.

Es bien conocido y descrito que el uso de combustibles fósiles es perjudicial para el medio ambiente y la atmósfera del planeta. También es bien sabido que los combustibles fósiles son un recurso finito que no puede durar indefinidamente.

Como resultado de esto ha habido mucha investigación sobre las fuentes de energía alternativas como la nuclear, eólica, solar, pilas de combustible de hidrógeno y los biocombustibles.

La demanda de combustible de origen biológico, es decir, ésteres metílicos de ácidos grasos ha crecido exponencialmente recientemente debido a diversas iniciativas internacionales gubernamentales para reducir la dependencia de los combustibles derivados del petróleo como el gasóleo y la gasolina.

Para satisfacer esta demanda se ha incrementado la presión sobre la agricultura para dedicar más tierras y recursos al cultivo de plantas oleaginosas como la soja, la colza y el maíz y, por lo tanto, hay menos tierra disponible para la producción de alimentos. Esta demanda ha llevado también a la deforestación de ciertas áreas con el fin de sembrar cultivos de semillas oleaginosas.

Es obvio para los expertos en la técnica que este procedimiento es más probable que conduzca a un aumento del calentamiento global y la pobreza del tercer mundo más que a aliviarlo.

El cultivo de tejidos de células vegetales se conoce como un procedimiento para propagación de plantas o para el cultivo de tejidos específicos de las plantas con el fin de cosechar productos vegetales específicos.

También es evidente que la producción de aceite vegetal para la producción de combustible es extremadamente intensiva para la tierra, ya que se produce menos de una tonelada de aceite por hectárea de tierra dedicada a la producción. Esto es debido al hecho de que sólo las semillas de la planta producen aceite y sólo ciertos tejidos dentro de la semilla. Por tanto, el resto del tejido de la planta se desperdicia en este procedimiento de producción. Además, cada planta debe ser plantada a una cierta distancia de su vecina (esta distancia dependerá de la especie vegetal utilizada) .

Por lo tanto, se ha hecho evidente que con el fin de satisfacer la creciente demanda mundial de biocombustibles se requiere una fuente o procedimiento de producción alternativo de estos combustibles.

El procedimiento actual para la producción de ésteres metílicos de ácidos grasos a partir de los aceites vegetales también tiene una desventaja importante, ya que en la producción de los ésteres metílicos los triglicéridos del aceite se descomponen en ácidos grasos libres y glicerina. El volumen de glicerina producida por este procedimiento es actualmente más que la demanda de fuentes industriales para el producto. Esto conducirá a más problemas en el futuro, ya que habrá que desarrollar procedimientos para la eliminación segura de glicerina a gran escala.

Es bien sabido en la técnica que las células vegetales se pueden mantener en cultivo de tejidos. El cultivo de tejidos es un término usado para describir el procedimiento por el que las células vegetales se cultivan fuera de una planta intacta en un medio nutriente adecuado. El cultivo de tejidos se define como un procedimiento en el que partes de una planta se transfieren a un ambiente artificial en el que pueden seguir sobreviviendo. El término cultivo de tejidos tal como se entiende en la técnica se refiere a tejido cultivado que puede consistir en células individuales o grupos de células vegetales, protoplastos o enteros o partes de un órgano de la planta.

En el cultivo de tejidos, las células vegetales se pueden cultivar sobre una superficie sólida como grumos de color pálido conocidos como cultivo de callo o como agrupaciones individuales o pequeñas de células conocidas como cultivo en suspensión. Las células crecidas en cultivo se están dividiendo activamente y se pueden mantener en un estado indefinidamente no diferenciado mediante la transferencia de las células a medio fresco (subcultivo) . Las células cultivadas también pueden ser inducidas a rediferenciarse en plantas enteras.

El cultivo de tejidos es bien conocido en el campo de la biología vegetal y tiene varias aplicaciones, por ejemplo, puede ser utilizado para producir grandes cantidades de plantas o material vegetal en un corto período de tiempo (micropropagación) .

Los cultivos de tejidos vegetales se pueden iniciar desde casi cualquier parte de la planta de origen (denominado explante) , aunque las partes más jóvenes de la planta son en general más útiles, ya que contienen más células que se dividen activamente.

Aunque el cultivo de tejidos es bien conocido en la técnica, las diferentes plantas pueden variar en las condiciones exactas requeridas para mantener las células en cultivo.

Weselake et al, 1989, J. Exp. Bot., 49, 33-39 divulgan un estudio de biosíntesis de triacilglicerol en cultivos derivados de suspensión celular de microsporas de Brassica napus Los autores notificaron un incremento del contenido en sacarosa del medio de cultivo del 2 % al 22 % (peso/volumen) que aumentaba el contenido en triacilglicerol de las células cultivadas.

Los autores enseñan la extracción de los triacilgliceroles de células mediante un procedimiento de hexano/isopropanol. No se menciona nada del pH del cultivo.

Leathers y Scragg, 1989, Plant Sci., 62, 217-227 describen una investigación sobre el efecto de la temperatura sobre el crecimiento, el contenido lipídico y la composición en ácidos grasos de cultivos de suspensión celular de Theobroma cacoa. Los autores usaron un medio de cultivo de suspensión celular con un pH de 5, 7 y enseña que los lípidos se extraían en disolvente de células liofilizadas.

La patente de EE.UU. nº 5.936.139 enseña la ingeniería genética de plantas con un gen de la ciclopropano ácido graso sintasa bacteriana para fabricar lípidos que contienen ácidos grasos de ciclopropano (Resumen) . De acuerdo con el ejemplo 1, los lípidos se extraen de un callo de células vegetales sometidos a ingeniería genética usando extracción con hexano/isopropanol y después se transesterifican con metóxido sódico para fabricar FAME. No existe divulgación alguna en el presente documento de un cultivo de suspensión de células vegetales; se dice que su innovación está relacionada con la regeneración de plantas transgénicas enteras (col. 3, línea 47-49) y el ejemplo 1 solo enseña en uso de excrecencias callosas para producir lípidos.

El documento US 2007/048848 se refiere a cultivos de algas. Los párrafos [0008], [0053]-[0064] y el ejemplo 1 describen un medio no continuo de recolectar aceite de células de algas que requiere separar las células del medio de cultivo y a continuación extraer el aceite de las células. El documento US 2007/048848 no enseña ni sugiere células en cultivo en suspensión de células vegetales (las algas no son plantas) , mucho menos uno que se mantenga en condiciones tales que las células sean capaces de secretar aceite al medio de cultivo. En el documento US 2007/048848 no se menciona nada del pH del cultivo.

Martinez-Estevez et al, 2001, Plant Cell Rep., 20, 469-474 describe el desarrollo de un sistema experimental para investigar la toxicidad del aluminio en cultivos de suspensión de células embrionarias de Coffea arabica. Los autores concluyeron que las condiciones de cultivo del pH que incluyen un pH de 4, 3 proporcionaron las condiciones óptimas para obtener toxicidad del aluminio. Los autores no comentaron ningún aspecto de la producción de aceite por el cultivo celular.

Las células en cultivo de tejidos son generalmente diferentes de las de una planta intacta. También es bien conocido en la técnica que las células vegetales cultivadas producen diferentes cantidades y cantidades alteradas de metabolitos (Dicosmo y G Delle Monache, 1995, Phytochemistr y , 39, 575-580) .

El presente inventor ha demostrado sorprendentemente que las células cultivadas a partir de la semilla de Triticum vulgare y también a partir de la soja tienen sorprendentemente un perfil de ácidos grasos y triglicéridos similar al de los compuestos que se encuentran en toda... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la producción de al menos un ácido graso y/o aceite de un cultivo en suspensión de células vegetales, comprendiendo el procedimiento

(i) mantener un cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite a un pH inferior a 7, 0, de un modo tal que las células cultivadas sintetizan y secretan al menos un ácido graso y/o aceite en el medio de cultivo celular en suspensión; y

(ii) extraer el al menos un ácido graso y/o aceite así secretado del medio del cultivo celular en suspensión.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cultivo en suspensión de células vegetales se mantiene a un pH inferior a 6, 5, 6, 0 o 5, 5, preferentemente un pH de 3, 5 a 5, 5.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el medio de cultivo celular en suspensión comprende un tampón que mantiene el medio de cultivo celular en suspensión a aproximadamente el pH seleccionado.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la viabilidad del cultivo de células vegetales se mantiene durante la etapa de extracción del al menos un ácido graso y/o aceite secretado de este modo del medio de cultivo celular en suspensión.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el procedimiento es un procedimiento para la recolección continua de al menos un ácido graso y/o aceite del medio de cultivo celular en suspensión.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el pH al cual se mantiene el medio de cultivo celular en suspensión es un pH de 4, 5 a 6, 5, más preferentemente un pH de 4, 5 a 5, 5 y opcionalmente la secreción de el al menos un ácido graso y/o aceite de las células cultivadas en el medio de cultivo de la suspensión celular circundante tiene como resultado la formación de un sistema bifásico en el que el al menos un ácido graso y/o aceite se acumula en una capa separada del medio del cultivo celular en suspensión.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la etapa de extraer el al menos un ácido graso y/o aceite así secretado del medio del cultivo celular en suspensión comprende la extracción directa de al menos un ácido graso y/o aceite de la capa que forma dentro del sistema bifásico, preferentemente sin la eliminación completa de la capa de modo que también puede seguir actuando como barrera frente al movimiento de patógenos entre la atmósfera y el medio de cultivo celular en suspensión.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula vegetal productora de aceite es una célula vegetal diferenciada, preferentemente una célula que está especializada en la producción y el almacenamiento de aceites, tal como una célula de mesodermo.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula vegetal productora de aceite es de una planta productora de aceite, tales como una planta seleccionada del grupo que consiste en Triticum, Brassica, Zea, Rhus, Olea y Glycine.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el al menos un ácido graso y/o aceite que se extrae se procesa después para convertirlo en un biocombustibles, o se purifica y/o usa después en un procedimiento posterior tal como mediante incorporación en un producto alimenticio, cosmético o lubricante.

11. Un cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite como se ha definido en cualquier reivindicación anterior en el que el pH del cultivo celular en suspensión es inferior a un pH de 5, 5 ± 0, 1 y en el que

(a) el cultivo celular en suspensión comprende un medio de cultivo que está tamponado a un pH inferior a 5, 5; y/o

(b) el cultivo celular en suspensión es un sistema bifásico que comprende un medio de cultivo que comprende las células vegetales productoras de aceite en suspensión en una capa, y ácido graso y/o aceite sintetizado y secretado por las células vegetales productoras de aceite en otra capa, en donde la capa de ácido graso y/o aceite es pequeña con respecto al medio de cultivo.

12. Uso del cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para producir al menos un ácido graso y/o aceite, en el que el pH del cultivo de suspensión celular de las células vegetales productoras de aceite es inferior a un pH de 5, 5 ± 0, 1 y en el que el al menos un ácido graso y/o aceite se secreta en el medio de cultivo celular en suspensión.

13. Un medio de cultivo celular en suspensión de células vegetales tamponado que tiene un pH menor de un pH de 5, 5, tal como mayor de un pH de 3, 0 a menor de 5, 5, preferentemente un pH de 4, 5 a menor de 5, 5, para cultivar un cultivo de células vegetales en suspensión mediante un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. Uso de un medio de cultivo celular en suspensión de células vegetales tamponado que tiene un pH menor de 7, 0 para mantener un cultivo celular en suspensión de células vegetales productoras de aceite como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, de un modo tal que las células sintetizan y secretan al menos un ácido graso y/o aceite en el medio de cultivo celular en suspensión.