Procedimientos y composiciones para la biosíntesis recombinante de n-alcanos.

Un procedimiento para producir hidrocarburos, que comprende:

(i) cultivar una cianobacteria genomanipulada en un medio de cultivo,

donde dicha bacteria genomanipuladacomprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasadecarboxilativa recombinante; y

(ii) exponer dicha cianobacteria genomanipulada a la luz y al dióxido de carbono, donde dicha exposición dacomo resultado la conversión de dicho dióxido de carbono mediante dicha cianobacteria genomanipulada enn-alcanos, donde al menos uno de dichos n-alcanos se selecciona entre el grupo que consiste en n-tridecano,n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanosproducida es al menos de 0,1% del peso de células secas y al menos dos veces la cantidad producida poruna cianobacteria idéntica en todo lo demás, cultivada en condiciones idénticas, pero que carece de dichasenzimas acil-ACP reductasa recombinante y alcanal monooxigenasa decarboxilativa.

Procedimientos y composiciones para la biosintesis recombinante de n-alcanos

Referencias cruzadas con las solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/224.463 presentada el 9 de julio de 2009, la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/228.937, presentada el 27 de julio de 2009, y la solicitud de utilidad de los Estados Unidos 12/759.657, presentada el 13 de abril de 2010, presentadas con anterioridad.

Campo de la invención La presente divulgacion se refiere a procedimientos para conferir propiedades productoras de alcanos a una cianobacteria hospedadora, de tal manera que el hospedador se puede usar en la produccion comercial de bioalcanos.

Antecedente de la invención Muchos organismos fotoautotrofos existentes (es decir, plantas, algas, y bacterias fotosinteticas) son poco adecuados para el bioprocesamiento industrial y no han demostrado por tanto viabilidad comercial. Dichos organismos tienen normalmente tiempos de duplicacion lentos (3-72 horas) , en comparacion con los organismos heterotrofos industrializados tales como Escherichia co/i (20 minutos) , que reflejan bajas productividades totales. Aunque el deseo de una produccion biosintetica de combustibles eficaz ha conducido al desarrollo de microorganismos fotosinteticos que producen esteres de alquilo de acidos grasos, sigue existiendo necesidad de procedimientos para producir hidrocarburos, por ejemp/o, alcanos, utilizando organismos fotosinteticos.

Resumen de la invención La presente invencion se refiere a procedimientos para producir productos de interes basados en carbono utilizando los genes AAR y ADN, las proteinas y las celulas hospedadoras descritas en el presente documento. En particular, la presente invencion proporciona un procedimiento para producir hidrocarburos que comprende:

(i) cultivar una cianobacteria genomanipulada en un medio de cultivo, donde dicha bacteria genomanipulada comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante;

(ii) exponer dicha cianobacteria genomanipulada a la luz y al dioxido de carbono, donde dicha exposicion da como resultado la conversion de dicho dioxido de carbono mediante dicha cianobacteria genomanipulada en n-alcanos, donde al menos uno de dichos n-alcanos se selecciona entre el grupo que consiste en n-tridecano, n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos de 0, 1% del peso de celulas secas y al menos dos veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa recombinante y alcanal monooxigenasa decarboxilativa. En una realizacion, la cantidad de dichos n-alcanos producida esta entre 0, 1% y 5% del peso de celulas secas y al menos dos 45 veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas enzimas AAR y ADM. En una realizacion relacionada, la cantidad de n-alcanos producida por la cianobacteria genomanipulada es al menos de 0, 1%, 0, 2%, 0, 3%, 0, 4%, 0, 5%, 0, 6%, 0, 7%, 0, 8%, 0, 9%, o 1% del DCW, y al menos dos veces la cantidad producida por la cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas enzimas AAR y ADM recombinantes. En una realizacion relacionada, al menos una de dichas enzimas recombinantes es heterologa con respecto a dicha cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion, dicha cianobacteria no sintetiza alcanos en ausencia de la 55 expresion de una o ambas enzimas recombinantes. En otra realizacion, al menos una de dichas enzimas AAR o ADM recombinantes no es heterologa para dicha cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion relacionada del procedimiento, dicha cianobacteria genomanipulada produce al menos un nalqueno o n-alcanol. En otra realizacion mas, la cianobacteria genomanipulada produce al menos un n-alqueno o nalcanol seleccionado entre el grupo que consiste en n-pentadeceno, n-heptadeceno, y 1-octadecanol. En una realizacion relacionada, dichos n-alcanos comprenden de forma predominante n-heptadecano, n-pentadecano o una de sus combinaciones en una realizacion relacionada, se producen mas n-heptadecano y/o n-pentadecano que todos los otros productos de n-alcano combinados. En otra realizacion adicional relacionada, se producen mas nheptadecano y/o n-pentadecano por la bacteria genomanipulada que cualesquiera otros n-alcano o n-alqueno 65 producidos por la cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion adicional relacionada, se selecciona al menos un n-pentadeceno producido por dicha cianobacteria genomanipulada entre el grupo que consiste en cis-3heptadeceno y cis-4-pentadeceno. En otra realizacion mas relacionada, se selecciona al menos un n-heptadeceno producido por dicha cianobacteria genomanipulada entre el grupo que consiste en cis-4-pentadeceno, cis-6heptadeceno, cis-8-heptadeceno, cis-9-heptadeceno, y cis, cis-heptadec-di-eno.

En otra realizacion adicional relacionada, la presente invencion proporciona ademas una etapa de aislamiento de al menos un n-alcano, n-alqueno o n-alcanol procedente de dicha cianobacteria genomanipulada o dicho medio de cultivo. En otra realizacion mas relacionada, la cianobacteria genomanipulada se cultiva en un medio liquido. En otra realizacion mas relacionada, la cianobacteria genomanipulada se cultiva en un fotobiorreactor.

En otra realizacion relacionada, las enzimas AAR y/o ADM estan codificadas por un plasmido. En otra realizacion mas relacionada, las enzimas AAR y/o ADM estan codificadas por genes recombinantes incorporados al genoma de la cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion adicional relacionada, las enzimas AAR y/o AQDM estan codificadas por genes que estan presentes en multiples copias en dicha cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion adicional relacionada, las enzimas AAR y/o ADM recombinantes estan codificadas por genes que son 15 parte de un operon, donde la expresion de dichos genes esta controlada por un unico promotor. En otra realizacion mas relacionada, las enzimas AAR y/o ADM recombinantes estan codificadas por genes que se expresan de forma independiente bajo el control de promotores separados. En otra realizacion adicional relacionada, la expresion de las enzimas AAR y/o ADM recombinantes en una cianobacteria genomanipulada esta controlada por un promotor seleccionado entre el grupo que consiste en un promotor cl, un promotor cpcB, un promotor /ac/-trc, un promotor EM7, un promotor aphll, un promotor nirA, y un promotor nir07 (denominado en el presente documento "P (nir07) ") . En otra realizacion mas relacionada, las enzimas estan codificadas por genes que son parte de un operon, donde la expresion de dichos genes esta controlada por uno o mas promotores inducibles. En otra realizacion adicional relacionada, al menos un promotor es represible por urea e inducible por nitrato. En una realizacion mas relacionada, el promotor represible por urea e inducible por nitrato es un promotor de tipo nirA, En otra realizacion mas relacionada, el promotor de tipo nirA es P (nir07) (SEC 1D N°: 24) .

En otra realizacion adicional relacionada, la especie de cianobacteria que se genomanipula para expresar las enzimas AAR y/o ADM recombinantes produce menos de aproximadamente 0, 01% del DCW de n-heptadecano o npentadecano en ausencia de las enzimas AAR y/o ADM recombinantes, un 0, 015 del DWC corresponde aproximadamente al limite de deteccion del n-heptadecano y n-pentadecano mediante los procedimientos de deteccion de la cromatografia de gases/ionizacion por llama descritos en el presente documento. En otra realizacion relacionada, la cianobacteria genomanipulada del procedimiento es un organismo termofilo. En otra realizacion mas relacionada, la cianobacteria genomanipulada del procedimiento se selecciona entre el grupo que consiste en un Synechococcus sp. PCC7002 genomanipulado y un Thermosynechococcus e/ongatus BP-1 genomanipulado.

En otra realizacion mas relacionada, las enzimas AAR y/o ADM se seleccionan entre el grupo de enzimas relacionadas en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente. En otra realizacion adicional relacionada, las enzimas AAR recombinantes se seleccionan entre el grupo que consiste en SYNPCC7942 1594, t111312, PMT9312 0533, y cce 1430. En otra realizacion mas relacionada, las enzimas ADM recombinantes se seleccionan entre el grupo que consiste en SYNPCC7942 1593, t111313, PMT9312 0532, y cce 0778.

En otra realizacion adicional relacionada, las enzimas AAR y ADM recombinantes tienen las secuencias de aminoacidos de la SEC 1D N°: 10 y la SEC 1D N°: 12, respectivamente. En determinadas realizaciones,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir hidrocarburos, que comprende:

(i) cultivar una cianobacteria genomanipulada en un medio de cultivo, donde dicha bacteria genomanipulada comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante; y

(ii) exponer dicha cianobacteria genomanipulada a la luz y al dioxido de carbono, donde dicha exposicion da como resultado la conversion de dicho dioxido de carbono mediante dicha cianobacteria genomanipulada en n-alcanos, donde al menos uno de dichos n-alcanos se selecciona entre el grupo que consiste en n-tridecano, n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos de 0, 1% del peso de celulas secas y al menos dos veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa recombinante y alcanal monooxigenasa decarboxilativa.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde al menos una de dichas enzimas recombinantes es heterologa con respecto a dicha cianobacteria genomanipulada.

3. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde dicha cianobacteria genomanipulada produce ademas al menos un n-alqueno o n-alcanol.

4. El procedimiento de la reivindicacion 3, donde dicha cianobacteria genomanipulada produce al menos un nalqueno o n-alcanol seleccionado entre el grupo que consiste en n-pentadeceno, n-heptadeceno, y 1-octadecanol.

5. El procedimiento de la reivindicacion 3, donde dichos n-alcanos comprenden de forma predominante nheptadecano, n-pentadecano o una de sus combinaciones.

6. El procedimiento de la reivindicacion 3, que comprende ademas aislar al menos un n-alcano, n-alqueno o nalcanol a partir de dicha cianobacteria genomanipulada o dicho medio de cultivo.

7. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde dichas enzimas estan codificadas por un plasmido.

8. El procedimiento de la reivindicacion 1 donde dichas enzimas estan codificadas por genes recombinantes incorporados en el genoma de dicha cianobacteria genomanipulada.

9. El procedimiento de la reivindicacion 1 donde dichas enzimas estan codificadas por genes que estan presentes en multiples copias en dicha cianobacteria genomanipulada.

10. El procedimiento de la reivindicacion 1 donde dichas enzimas estan codificadas por genes que son parte de un operon, y donde la expresion de dichos genes esta controlada por un unico promotor.

11. Una cianobacteria genomanipulada, donde dicha bacteria genomanipulada comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante; y donde dicha cianobacteria, cuando se cultiva en presencia de luz y dioxido de carbono, produce n-alcanos, donde al menos uno de dichos n-alcanos se selecciona entre el grupo que consiste en n-tridecano, n-tetradecano, n-pentadecano, nhexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos un 0, 1% del peso de celulas secas y al menos dos veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa y alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes.

12. La cianobacteria genomanipulada de la reivindicacion 11, donde dichas enzimas estan codificadas por genes que estan presentes en multiples copias en dicha cianobacteria genomanipulada; preferentemente donde dichas enzimas estan codificadas por un plasmido.

13. La cianobacteria genomanipulada de la reivindicacion 11 o 12, donde dichas enzimas estan codificadas por genes que son parte de un operon, y donde la expresion de dichos genes esta controlada por un unico promotor.

14. La cianobacteria genomanipulada de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde la expresion de las enzimas acil-ACP reductasa o alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes en dicha cianobacteria genomanipulada esta controlada por un promotor seleccionado entre el grupo que consiste en un promotor cl, un promotor cpcB, un promotor lacl-trc, un promotor EM7, y un promotor aph11.

15. La cianobacteria genomanipulada de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde dicha cianobacteria genomanipulada es un termofilo.

16. Uso de una bacteria genomanipulada que comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante para producir n-alcanos cultivando dicha cianobacteria genomanipulada en presencia de luz y dioxido de carbono, donde al menos dichos n-alcanos se seleccionan entre el grupo que consiste en n-tridecano, n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos un 0, 1% del peso de celulas secas y al menos dos veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en identicas condiciones, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa y alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la secuencia de aminoacidos de dicha enzima acil-ACP reductasa es al menos un 95% identica a la SEC 1D N°: 6, SEC 1D N°: 10, o SEC 1D N°: 27, o donde la secuencia de aminoacidos de dicha enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa es al menos un 95% identica a la SEC 1D N°: 8; SEC 1D N°: 12 o SEC 1D N°: 29.

18. La cianobacteria genomanipulada de cualquiera de las reivindicaciones 11-15, donde la secuencia de aminoacidos de dicha enzima acil-ACP reductasa es al menos un 95% identica a la SEC 1D N°: 6, SEC 1D N°: 10, o SEC 1D N°: 27, o donde la secuencia de aminoacidos de dicha enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa es al menos un 95% identica a la SEC 1D N°: 8, SEC 1D N°: 12 o SEC 1D N°: 29.

19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde las secuencias de aminoacidos de dicha enzima acil-ACP reductasa y dicha alcanal monooxigenasa decarboxilativa son al menos un 95% identicas a (i) la SEC 1D N°: 6 y la SEC 1D N°: 8, respectivamente; (ii) la SEC 1D N°: 10 y la SEC 1D N°: 12, respectivamente, o (iii) la SEC 1D N°: 27 y la SEC 1D N°: 29, respectivamente.

20. La cianobacteria genomanipulada de cualquiera de las reivindicaciones 11-15, donde las secuencias de aminoacidos de dicha enzima acil-ACP reductasa y dicha alcanal monooxigenasa decarboxilativa son al menos un 95% identica a (i) la SEC 1D N°: 6 y la SEC 1D N°. 8, respectivamente; (ii) la SEC 1D N°: 10 y la SEC 1D N°: 12; o (iii) la SEC 1D N°: 27 y la SEC 1D N°: 29, respectivamente.

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