Procedimientos y aparatos para la formación confocal de imágenes.

Aparato para la formación de imágenes que comprende:

(a) una fuente de radiación dispuesta para enviar radiación de excitación,

como mínimo, a una parte de una regiónde muestra;

(b) un conjunto detector rectangular que tiene elementos que convierten la energía de los fotones contactados enuna repuesta eléctrica, encontrándose dichos elementos en una disposición bidimensional, ortogonal, en la queuna primera dimensión es más larga que una segunda dimensión;

(c) una óptica de formación de imágenes dispuesta para dirigir una imagen rectangular de dicha parte a dichoconjunto detector rectangular; y

(d) un dispositivo de escaneado configurado para escanear dicha región de muestra en una dimensión de eje deescaneado, de manera que la parte de dicha región de muestra que forma una imagen rectangular en dichoconjunto detector rectangular, es cambiada,

en el que la más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto detector rectangular y la más cortade las dos dimensiones rectangulares para dicha imagen se encuentran en dicha dimensión del eje de escaneado, yen el que dicha dimensión más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto de detectorrectangular es suficientemente corta para conseguir confocalidad en un eje único de dicho conjunto detectorrectangular, de manera que dicho eje único es dicha dimensión más corta de las dos dimensiones rectangularespara dicho conjunto detector rectangular.

Procedimientos y aparatos para la formación confocal de imágenes Antecedentes La presente invención se refiere de manera general al sector de formación de imágenes ópticas. De manera específica, la presente invención se refiere a sistemas de formación de imágenes para su utilización en la detección de microconjuntos de muestras.

Los microscopios ópticos proporcionan una potente herramienta para investigar muestras con resolución submicrónica. Por ejemplo, en biología y medicina, se utilizan etiquetas moleculares apropiadas, tales como etiquetas fluorescentes e inmunofluorescentes, para marcar moléculas individuales y se detectan señales exclusivas procedentes de las etiquetas por el microscopio óptico para identificar su presencia. La detección con resolución submicrónica permite, no solamente la determinación de la presencia de moléculas marcadas, sino también su localización en las células o tejidos y alrededor de los mismos.

Dos objetivos en conflicto de los sistemas de inspección mediante microscopía óptica se refieren a conseguir formación de imágenes de alta velocidad y de alta resolución. De manera típica, la resolución de un microscopio óptico es inversamente proporcional a la velocidad de formación de imágenes. Por esta razón, se consigue frecuentemente una mayor resolución con el sacrificio de una tasa de inspección más baja. Una técnica para acomodar el conflicto antes mencionado consiste en escoger selectivamente la resolución del sistema de acuerdo con características específicas de la muestra que está siendo observada u otras condiciones del experimento. De este modo, se puede utilizar una resolución más baja para conseguir velocidades más altas mientras se busca un área de interés en una muestra y a continuación, una vez se ha encontrado una localización de interés, la formación de imágenes puede ser llevada a cabo con una resolución más elevada a pesar del coste de incrementar el tiempo de adquisición de la imagen.

Se han realizado avances significativos en la capacidad de los microscopios para investigar muestras en tres dimensiones. La aparición de los microscopios confocales y mejoras conseguidas mediante la tecnología relacionada con los mismos, permiten la detección de un punto individual en el espacio tridimensional en alta resolución rechazando al mismo tiempo señales no deseadas procedentes del volumen que rodea dicho punto. La microscopía confocal de exploración se puede llevar a cabo para desplazar de manera efectiva el punto de detección mediante la muestra, y recoger una señal de cada punto para reconstruir una imagen tridimensional precisa de la muestra.

La tecnología desarrollada para microscopía óptica ha sido ampliada también a otros campos de la detección de imágenes. Por ejemplo, la tecnología ha sido utilizada para obtener imágenes de microconjuntos de muestras que contienen miles de muestras moleculares acopladas a la superficie de un sustrato. La formación de imagen de la superficie de los microconjuntos de muestras después de exposición a una muestra biológica de interés permite la evaluación simultánea de miles de moléculas objetivos, proporcionando de esta manera grandes cantidades de información con respecto a la muestra. Por ejemplo, se pueden utilizar los microconjuntos de muestras para determinar el número y tipo de genes que son expresados en condiciones específicas que, a su vez, proporcionan una visión holística de la respuesta biológica al estado. Además, se pueden evaluar similitudes y diferencias entre la constitución genética de individuos utilizando microconjuntos de muestras tales que la base genética para trazos específicos puede ser determinada. Se puede utilizar información con respecto a las respuestas de expresión de genes y constitución genética de individuos para objetivos de diagnóstico y de pronóstico, por ejemplo, para determinar la susceptibilidad a cierta enfermedad o la respuesta a un medicamento específico.

Si bien la detección por microconjuntos de muestra se ha beneficiado de avances en la microscopía óptica, hay una serie de áreas que no se han enfocado adecuadamente con respecto a la formación de imágenes de microconjuntos de muestras. En particular, se han conseguido avances dirigidos a aumentar la resolución de las imágenes y a la eficiencia de la captación en microscopía óptica al mejorar la detección confocal tridimensional y alterar los niveles de ampliación. No obstante, la detección típica de microconjuntos de muestra es llevada a cabo solamente en dos dimensiones y para un nivel de ampliación fijo. Además, muchos de los avances en microscopía óptica de alta resolución han favorecido mejoras en la resolución con respecto a la velocidad de escaneado. Estos avances son favorables para la formación de imagen de muestras pequeñas, del orden de una o unas pocas células biológicas; no obstante, los avances no han beneficiado necesariamente el escaneado de alta resolución de muestras sustancialmente más grandes, tales como los microconjuntos de muestras.

El documento WO 99/47963 A1 da a conocer un sistema de formación de imágenes por microscopía confocal en el que se utiliza o bien un detector de línea o una máscara de ranura combinada con un conjunto detector bidimensional.

El documento EP 1 586 931 A2 da a conocer un microscopio confocal de ranura que comprende un dispositivo detector lineal monodimensional sobre el que se dirige una imagen mediante una máscara de ranura.

El documento WO 02/075292 A2 da a conocer un aparato de espectroscopia en el que se forma una imagen de una parte de una muestra sobre un dispositivo detector bidimensional. Ciertas áreas de la parte de la muestra son seleccionadas para el proceso adicional desplazando una máscara de ranura en una dirección y combinando las señales de todos los dispositivos detectores entre la ranura y una cierta dimensión perpendicular a la ranura.

Por lo tanto, existe la necesidad de dispositivos y procedimientos de escaneado que permiten formar imágenes de microconjuntos de muestras y otros sustratos bidimensionales en alta resolución y elevada velocidad. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona también otras ventajas.

BREVE DESCRIPCIÓN

La presente invención da a conocer un nuevo enfoque para formación de imágenes y análisis de microconjuntos de muestras para satisfacer las necesidades indicadas. La técnica puede ser utilizada con un amplio rango de tecnologías de microconjuntos de muestras, incluyendo conjuntos constituidos por microcuentas, fotolitografía, técnicas de impresión, electroquímica, y otros. La técnica se basa en escaneado confocal de línea del microconjunto de muestras para formar una imagen de lugares individuales sobre un sustrato. Las líneas escaneadas pueden comprender más de una longitud de onda de luz, tal como un par de longitudes de onda complementarias para la lectura de diferentes colores en un retro-haz, resultando de la excitación por longitudes de onda combinada de láseres, dirigidos confocalmente hacia líneas sucesivas en lugares sobre el microconjunto de muestras. La utilización de escaneado de línea confocal mejora notablemente la velocidad de formación de imagen del microconjunto de muestras, reduciendo al mismo tiempo significativamente el potencial de interferencia como resultado de excitación no deseada de lugares adyacentes en el conjunto.

La invención da a conocer un aparato para la formación de imágenes. El aparato para formación de imágenes puede comprender (a) una fuente de radiación dispuesta para enviar radiación de excitación a, como mínimo, una parte de una región de muestra; (b) un conjunto detector rectangular que tiene elementos que convierten la energía de los botones contactados en una respuesta eléctrica, encontrándose dichos elementos en una disposición bidimensional, ortogonal, en la que una primera dimensión es más larga que una segunda dimensión; (c) óptica de formación de imágenes dispuesta para dirigir una imagen rectangular de la parte del conjunto detector rectangular; y (d) un dispositivo de escaneado configurado para escanear la zona de la muestra en una dimensión de eje de escaneado, de manera que la parte de la región de la muestra que forma una imagen rectangular en el conjunto detector rectangular es cambiada, de manera que la más corta de dos dimensiones rectangulares para el conjunto detector rectangular y la más corta de las dos dimensiones rectangulares para la imagen se encuentran en la dimensión del eje de escaneado, y de manera que la más corta de las dimensiones rectangulares para el conjunto detector rectangular es suficientemente corta para conseguir la confocalidad en un eje único del conjunto detector rectangular,... [Seguir leyendo]

1. Aparato para la formación de imágenes que comprende:

(a) una fuente de radiación dispuesta para enviar radiación de excitación, como mínimo, a una parte de una región de muestra;

(b) un conjunto detector rectangular que tiene elementos que convierten la energía de los fotones contactados en una repuesta eléctrica, encontrándose dichos elementos en una disposición bidimensional, ortogonal, en la que una primera dimensión es más larga que una segunda dimensión;

(c) una óptica de formación de imágenes dispuesta para dirigir una imagen rectangular de dicha parte a dicho conjunto detector rectangular; y

(d) un dispositivo de escaneado configurado para escanear dicha región de muestra en una dimensión de eje de escaneado, de manera que la parte de dicha región de muestra que forma una imagen rectangular en dicho conjunto detector rectangular, es cambiada,

en el que la más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto detector rectangular y la más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicha imagen se encuentran en dicha dimensión del eje de escaneado, y en el que dicha dimensión más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto de detector rectangular es suficientemente corta para conseguir confocalidad en un eje único de dicho conjunto detector rectangular, de manera que dicho eje único es dicha dimensión más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto detector rectangular.

2. Aparato, según la reivindicación 1, que comprende, además, un generador de línea dispuesto para recibir radiación de excitación desde dicha fuente de radiación, y enviar una línea de radiación a dicha región de muestra.

3. Aparato, según la reivindicación 2, en el que la más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicha línea de radiación es suficientemente corta para conseguir confocalidad en un eje único de dicho conjunto detector rectangular, de manera que dicho eje único es dicha dimensión más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto detector rectangular.

4. Aparato, según la reivindicación 1, que comprende, además, un microconjunto soportado por una platina de translación, de manera que dicho conjunto es facilitado a dicha región de muestra.

5. Aparato, según la reivindicación 1, en el que dicho conjunto detector rectangular está configurado para funcionamiento TDI (Integración de Retraso de Tiempo) .

6. Aparato, según la reivindicación 1, en el que la relación de aspecto de dicho detector rectangular es superior a 20.

7. Aparato, según la reivindicación 1, en el que dicho aparato está configurado para obtener una imagen de dicha muestra que comprende una resolución de Rayleigh comprendido entre 0, 2 y 10 micras.

8. Procedimiento de obtención de una imagen de una muestra, que comprende:

(a) contactar, como mínimo, una primera parte de una muestra con radiación de excitación bajo condiciones en las que se emana una radiación desde dicha primera parte;

(b) dirigir dicha radiación emanada desde dicha primera parte para formar una imagen rectangular de dicha primera parte en un conjunto detector rectangular que tiene elementos que convierten la energía de los fotones contactados en una respuesta eléctrica, encontrándose dichos elementos en una disposición bidimensional ortogonal, en la que una primera dimensión es más larga que una segunda dimensión; y

(c) escanear dicha región de muestra en una dimensión de eje de escaneado, repitiendo de esta manera las etapas

(a) y (b) para formar una imagen rectangular de una segunda parte de dicha muestra en dicho conjunto detector rectangular,

en el que la más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto detector rectangular y la más corta de las dos dimensiones rectangulares para dichas imágenes se encuentran en dicha dimensión del eje de escaneado, y en el que dicha dimensión más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto detector rectangular es suficientemente más corta para conseguir confocalidad en un eje único de dicho conjunto detector rectangular, en el que dicho eje único es dicha dimensión más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto detector rectangular.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que dicha radiación de excitación que establece contacto, como mínimo, con una parte de dicha muestra, comprende una línea de radiación.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que la dimensión más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicha línea de radiación es suficientemente corta para conseguir confocalidad en un eje único de dicho conjunto

detector rectangular, en el que dicho eje único es dicha dimensión más corta de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto detector rectangular.

11. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que dicho escaneado de la muestra comprende el

desplazamiento de dicha muestra, cambiando de esta manera las posiciones relativas de dicha imagen rectangular y dicho conjunto detector rectangular en dicha dimensión del eje de escaneado.

12. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que dicho escaneado comprende TDI (Integración de Retraso de Tiempo) . 10

13. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que dicha muestra comprende un microconjunto que tiene una serie de lugares individuales.

14. Procedimiento, según la reivindicación 8, que comprende, además, la distinción de lugares individuales 15 separados por una distancia comprendida en un rango de 0, 1 a 50 micras.

15. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que dicha imagen de dicha muestra comprende una resolución Rayleigh comprendida entre 0, 2 y 10 micras.