Procedimientos para determinar la presencia de una cantidad suficiente de muestra de fluido en un tira de ensayo.

Un procedimiento para detectar la presencia de cantidad suficiente de una muestra de fluido depositada en unatira de ensayo que tiene un electrodo de referencia y un electrodo de trabajo,

en el que el electrodo de trabajo estárecubierto con una capa de reactivo, el procedimiento comprendiendo:

aplicar un voltaje de ensayo directo entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un valorde corriente directo cerca del extremo del voltaje de ensayo directo, en el que el voltaje de ensayo directocomprende de 100 milivoltios a 600 milivoltios;

aplicar un voltaje de ensayo inverso de polaridad opuesta y sustancialmente igual magnitud al voltaje deensayo directo y medir un valor de corriente inverso cerca del extremo del voltaje de ensayo inverso, elvoltaje de ensayo inverso siendo de 100 milivoltios negativos a 600 milivoltios negativos;

calcular una proporción del valor de corriente inverso con el valor de corriente directo; y

determinar si la proporción del valor de corriente inverso con el valor de corriente directo está dentro de unintervalo de aceptación, el intervalo de aceptación siendo sustancialmente igual a dos cuando el electrodo dereferencia comprende alrededor de dos veces el área de superficie del electrodo de trabajo.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11190794.

Solicitante: LIFESCAN SCOTLAND LTD.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: BEECHWOOD BUSINESS PARK NORTH INVERNESS IV2 3ED REINO UNIDO.

Inventor/es: DAY, RICHARD, MICHAEL, LEACH,CHRISTOPHER,PHILIP, ANDERSON,GRETCHEN, BLYTHE,Stephen,Patrick, CARDOSI,Marco,F, MILLS,Leanne, FINCH,MATTHEW, THOMPSON,ARLENE, NAYLOR,NINA ANTONIA, BAILEY,ERIC JASON, DOLAN,MICHAEL PATRICK, COMSTOCK,LORRAINE, MCEVOY,MARY, SUTTON,THOMAS, DAY,EMMA VANESSA JAYNE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N27/327 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 27/00 Investigación o análisis de materiales mediante el empleo de medios eléctricos, electroquímicos o magnéticos (G01N 3/00 - G01N 25/00 tienen prioridad; medida o ensayo de variables eléctricas o magnéticas o de las propiedades eléctricas o magnéticas de los materiales G01R). › Electrodos bioquímicos.
  • G01N33/487 G01N […] › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › de material biológico líquido.
  • G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).

PDF original: ES-2445742_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

2. Descripción de la técnica relacionada Las tiras de ensayo de glucosa electroquímicas, tales como las que se usan en el kit de ensayo de sangre completa One Touch® Ultra®, que están disponibles en LifeScan, lnc., están diseñadas para medir la concentración de glucosa en una muestra de sangre de pacientes con diabetes. La medición de la glucosa se basa en la oxidación específica de la glucosa por la flavoenzima glucosa oxidasa. Las reacciones que pueden tener lugar en una tira de ensayo de glucosa se resumen a continuación en las Ecuaciones 1 y 2.

D-Glucosa+ GO (ox) - Ácido Glucónico + GO (red) (1)

GO (red) + 2 Fe (CN) 63-- GO (ox) + 2 Fe (CN) 64- (2)

Como se muestra en la Ecuación 1, la glucosa se oxida a ácido glucónico por acción de la forma oxidada de la glucosa oxidasa (GO (ox) ) . Se debe señalar que GO (ox) también puede denominarse "enzima oxidada". Durante la reacción de la Ecuación 1, la enzima oxidada GO (ox) se convierte en su estado reducido, lo que se representa como GO (red) (es decir, "enzima reducida") . A continuación, la enzima reducida GO (red) se reoxida de nuevo a GO (ox) por reacción con Fe (CN) 63- (denominado mediador oxidado o ferricianuro) como se muestra en la Ecuación 2. Durante la reoxidación de GO (red) a su estado oxidado GO (ox) . Fe (CN) 63-se reduce a Fe (CN) 64- (denominado mediador reducido o ferrocianuro ) .

Cuando las reacciones expuestas anteriormente se realizan con un voltaje de ensayo aplicado entre dos electrodos, se puede crear una corriente de ensayo por la reoxidación electroquímica del mediador reducido en la superficie del electrodo. De esta manera, como en un entorno ideal, la cantidad de ferricianuro creada durante la reacción química descrita anteriormente es directamente proporcional a la cantidad de glucosa en la muestra situada entre los electrodos, la corriente de ensayo generada sería proporcional al contenido de glucosa de la muestra. Un mediador, tal como el ferricianuro, es un compuesto que acepta electrones de una enzima tal como la glucosa oxidasa y después dona los electrones a un electrodo. Según se incrementa la concentración de glucosa en la muestra, la cantidad de mediador reducido que se forma también se incrementa, por tanto, hay una relación directa entre la corriente de ensayo resultante de la reoxidación del mediador reducido y la concentración de glucosa. En particular, la transferencia de electrones a través de la interfase eléctrica da lugar a un flujo de corriente de ensayo (2 moles de electrones por cada mol de glucosa que se oxida) . La corriente de ensayo que resulta de la introducción de glucosa se puede denominar, por tanto, corriente de glucosa.

Debido a que puede ser muy importante conocer la concentración de glucosa en la sangre, particularmente para las personas con diabetes, se han desarrollado sistemas de medición que usan los principios expuestos anteriormente para permitir a una persona normal recoger una muestra y comprobar su sangre para determinar la concentración de glucosa en cualquier momento dado. La corriente de glucosa generada se monitoriza por los sistemas de medición y se convierte en una lectura de la concentración de glucosa usando un algoritmo que relaciona la corriente de ensayo con una concentración de glucosa por medio de una fórmula matemática sencilla. En general, los sistemas de medición funcionan en conjunto con una tira de ensayo desechable que incluye una cámara de recepción de la muestra y al menos dos electrodos colocados en la cámara de recepción de muestra además de la enzima (por ejemplo, glucosa oxidasa) y el mediador (por ejemplo, ferricianuro) . En cuanto a su utilización, el usuario se pincha un dedo u otro sitio conveniente para inducir el sangrado e introduce una muestra de sangre en la cámara de recepción de la muestra, iniciándose de esta manera la reacción química expresada anteriormente.

En términos electroquímicos, la función del medidor es doble. Primero, proporciona un voltaje polarizante (aproximadamente de 0, 4 V en el caso de One Touch® Ultra®) que polariza la interfase eléctrica y permite el flujo de corriente en la superficie de carbono del electrodo de trabajo. Segundo, mide la corriente que fluye en el circuito externo entre el ánodo (electrodo de trabajo) y el cátodo (electrodo de referencia) . Por lo tanto, puede considerarse que el medidor de ensayo es un sistema electroquímico simple que funciona en modo de dos electrodos aunque, en la práctica, puede usarse un tercero o incluso un cuarto electrodo para facilitar la medición de la glucosa y/o llevar a cabo otras funciones del medidor del ensayo.

En la mayoría de las situaciones, la ecuación expuesta anteriormente se considera una aproximación suficiente de la reacción química que tiene lugar en la tira de ensayo y en el sistema de medición del ensayo que proporciona una representación suficientemente precisa del contenido en glucosa de la muestra de sangre. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias y para ciertos propósitos, puede ser ventajoso mejorar la precisión de la medición. Por ejemplo, las muestras de sangre que tienen un nivel alto o bajo del hematocrito pueden hacer que una medición de la glucosa sea imprecisa.

Un nivel de hematocrito representa un porcentaje del volumen de una muestra de sangre completa ocupado por glóbulos rojos. El nivel de hematocrito también puede representarse como una fracción de los glóbulos rojos presentes en una muestra de sangre completa. En general, una muestra de sangre con un hematocrito alto es más viscosa (hasta aproximadamente 10 centipoise a un hematocrito del 70%) que una muestra de sangre con un hematocrito bajo (aproximadamente 3 centipoise a un hematocrito del 20%) . Además, una muestra de sangre con un hematocrito alto tiene un contenido mayor de oxígeno que la sangre con hematocrito bajo debido al incremento concomitante de hemoglobina, que es un vehículo para el oxígeno. Por tanto, el nivel de hematocrito puede tener influencia sobre la viscosidad y el contenido de oxígeno de la sangre. Como se describirá más adelante, tanto la viscosidad como el contenido de oxígeno pueden cambiar la magnitud de la corriente de glucosa y, a su vez, hacer que la concentración de glucosa sea imprecisa.

Una muestra con viscosidad alta (es decir, una muestra de sangre con hematocrito alto) puede ocasionar que la corriente de ensayo disminuya por varios factores tales como un descenso en 1) la tasa de disolución de la enzima y/o el mediador, 2) la tasa de reacción de la enzima, y 3) la difusión de un mediador reducido hacia el electrodo de trabajo. Un descenso de la corriente que no está basado en un descenso de la concentración de glucosa puede potencialmente causar una imprecisión en la concentración de glucosa que se tiene que medir.

Una tasa de disolución más lenta de la capa de reactivo puede ralentizar la reacción enzimática que se ilustra en las Ecuaciones 1 y 2 debido a que la enzima oxidada GO (ox) debe disolverse primero antes de que pueda reaccionar con la glucosa. De forma similar, el ferricianuro (Fe (CN) 63-) debe disolverse primero antes de que pueda reaccionar con la enzima reducida GO (red) . Si la enzima oxidada no disuelta GO (ox) no puede oxidar la glucosa, entonces la enzima reducida GO (red) no puede producir el mediador reducido Fe (CN) 64-necesario para generar la corriente de ensayo. Además, la enzima oxidada GO ( (ox) reaccionará con la glucosa y el mediador oxidado Fe (CN) 63- más lentamente si está en una muestra con viscosidad alta que si está en una muestra con viscosidad baja. La tasa más lenta de reacción en las muestras con viscosidad alta se atribuye al descenso total en la difusión de masa. La enzima oxidada GO (ox) y la glucosa deben colisionar e interactuar juntas para que la reacción ocurra como se muestra en la Ecuación 1. La capacidad de la enzima oxidada GO (ox) y de la glucosa para colisionar e interactuar juntas está ralentizada cuando están en una muestra viscosa. Además, el mediador reducido Fe (CN) 64- difundirá hacia el electrodo de trabajo más lentamente cuando está disuelto en una muestra de viscosidad alta. Debido a que la corriente de ensayo está típicamente limitada por la difusión del mediador reducido Fe (CN) 64- hacia el electrodo de trabajo, una muestra con viscosidad alta también atenuará la corriente de ensayo. En resumen, hay varios factores que causan el descenso de la corriente de ensayo cuando la muestra tiene una viscosidad aumentada.

Un contenido alto de oxígeno también puede causar un descenso en la corriente de ensayo. La enzima reducida GO (red) puede reducir el oxígeno (O2) a peróxido de hidrógeno como se muestra en la Ecuación 3.

GO (red) + O2 -GO (ox) + H2O2 (3)

Como se señaló anteriormente,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para detectar la presencia de cantidad suficiente de una muestra de fluido depositada en una tira de ensayo que tiene un electrodo de referencia y un electrodo de trabajo, en el que el electrodo de trabajo está recubierto con una capa de reactivo, el procedimiento comprendiendo:

aplicar un voltaje de ensayo directo entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo y medir un valor de corriente directo cerca del extremo del voltaje de ensayo directo, en el que el voltaje de ensayo directo comprende de 100 milivoltios a 600 milivoltios; aplicar un voltaje de ensayo inverso de polaridad opuesta y sustancialmente igual magnitud al voltaje de ensayo directo y medir un valor de corriente inverso cerca del extremo del voltaje de ensayo inverso, el voltaje de ensayo inverso siendo de 100 milivoltios negativos a 600 milivoltios negativos; calcular una proporción del valor de corriente inverso con el valor de corriente directo; y determinar si la proporción del valor de corriente inverso con el valor de corriente directo está dentro de un intervalo de aceptación, el intervalo de aceptación siendo sustancialmente igual a dos cuando el electrodo de referencia comprende alrededor de dos veces el área de superficie del electrodo de trabajo.

2. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que la duración del voltaje de ensayo directo varía de alrededor de 0, 1 a alrededor de 1, 0 segundos; la magnitud del voltaje de ensayo directo comprende alrededor de 400 milivoltios; el valor de corriente directo se mide de alrededor de 0, 1 a alrededor de 1, 0 segundos después de que el voltaje de ensayo directo se haya aplicado a la tira de ensayo; la duración del voltaje de ensayo inverso varía de alrededor de 0, 1 a alrededor de 1, 0 segundos; la magnitud del voltaje de ensayo inverso comprende alrededor de 400 milivoltios; y el valor de corriente inversa se mide a alrededor de 0, 1 a alrededor de 1, 0 segundos después de que el voltaje de ensayo inverso se haya aplicado a la tira de ensayo.

3. El procedimiento de la Reivindicación 2, en el que el electrodo de trabajo comprende una pluralidad de microelectrodos formados de oro.

4. El procedimiento de la Reivindicación 2, en el que la capa de reactivo comprende un enzima, un mediador y una solución tampón en la que el mediador comprende rutenio hexamina.

5. El procedimiento de la Reivindicación 1, comprendiendo además:

representar el primer, segundo y tercer valores de corriente inversa como una función de una concentración de analitos como se ha medido en un instrumento de referencia y calcular una pendiente minversa de la línea de regresión lineal obtenida de la misma; representar el primer, segundo y tercer valores de corriente directa como una función de la concentración de analitos como se ha medido en un instrumento de referencia y calcular una pendiente mdirecta de la línea de regresión lineal obtenida de la misma; calcular una proporción de minversa con mdirecta; y determinar si la proporción de minversa con mdirecta está dentro del intervalo de aceptación, el intervalo de aceptación siendo sustancialmente igual a dos cuando el electrodo de referencia comprende alrededor de dos veces el área de superficie del electrodo de trabajo, el primer, segundo y tercer voltajes de ensayo directos y el primer, segundo y tercer voltajes de ensayo inversos son de igual magnitud y duración y el primer, segundo, tercer y cuarto voltajes de ensayo son de igual magnitud y duración.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la duración del voltaje de ensayo directo varía de alrededor de 0, 1 a alrededor de 1, 0 segundos; la magnitud del voltaje de ensayo directo comprende alrededor de 400 milivoltios; el valor de corriente directo se mide de alrededor de 0, 1 a alrededor de 1, 0 segundos después de que el voltaje de ensayo directo se ha aplicado a la tira de ensayo; la duración del voltaje de ensayo inverso varía de alrededor de 0, 1 a alrededor de 1, 0 segundos; la magnitud del voltaje de ensayo inverso comprende alrededor de 400 milivoltios; y el valor de la corriente inversa se mide de alrededor de 0, 1 a alrededor de 1, 0 segundos después de que el voltaje de ensayo inverso se ha aplicado a la tira de ensayo.

7. El método de la Reivindicación 6, en el que la capa de reactivo comprende un enzima, un mediador y una solución tampón en la que el mediador es cloruro de rutenio hexamina.


 

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