Procedimiento y kit de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino.

Procedimiento y kit de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino.

El procedimiento comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino. Dicha identificación puede realizarse amplificando por PCR en dicha muestra un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80 % respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3, determinando el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y realizando un diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar a partir de la información obtenida en el paso anterior.

Procedimiento y kit de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino.

CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención es el diagnóstico de enfermedades genéticas de herencia mendeliana simple (monogénica) en animales domésticos. En particular, la presente invención se refiere a la detección de la mutación responsable de la enfermedad genética denominada lisencefalia con hipoplasia cerebelar en el ganado ovino y al método de determinación del estatus genético de un individuo (sano, portador, enfermo) en relación con esta enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El término lisencefalia significa literalmente “cerebro liso” y engloba a un grupo de malformaciones severas del cerebro causadas por una migración anormal de las neuronas post-mitóticas al córtex en desarrollo. La lisencefalia se caracteriza por la ausencia total (agiria) o parcial (paquigiria) de circunvoluciones cerebrales. Se asocia con un córtex cerebral engrosado y heterotopia neuronal difusa.

Existen diversos tipos de lisencefalia, pero principalmente se clasifican en dos: lisencefalia clásica y lisencefalia pavimentosa. La lisencefalia con hipoplasia cerebelar (LHC) se constituye como una variante de estas, ya que a las malformaciones a nivel del córtex cerebral (que pueden ser de tipo clásica o pavimentosa) se asocia un subdesarrollo del cerebelo. Dentro de la LHC se pueden distinguir seis subtipos.

La base genética de la LHC ovina no ha sido descrita y por tanto no existe actualmente un marcador genético para esta enfermedad del ganado ovino que pueda utilizarse para predecir el estatus de portador o no portador de animales sanos en rebaños en los que se haya identificado la enfermedad.

El procedimiento diagnóstico de la LHC descrito en la presente invención se basa en que en la presente invención se ha identificado una mutación asociada a la enfermedad en un fragmento del gen RELN, que codifica para la proteína Reelina. La Reelina es una proteína extracelular implicada en la migración neuronal postmitótica durante el periodo embrionario que juega un papel clave en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC) .

En humanos, mutaciones en el gen RELN provocan una LHC conocida como lisencefalia tipo 2 o síndrome Norman Roberts (OMIM: 257320) . En roedores, alteraciones en la reelina o en su cascada de señalización originan el fenotipo reeler. Los roedores reeler han sido ampliamente estudiados tanto por ser un modelo de la enfermedad humana como por su utilidad a la hora del estudio de la migración neuronal y desarrollo del SNC.

El gen RELN está situado en el cromosoma ovino 4 (OAR4) , en la región 44.668.137- 45.204.609 pb según la versión Oarv3.1 del genoma ovino. La distribución de exones e intrones a lo largo de las 536.472 Kb del ADN que contiene el gen RELN no se ha determinado anteriormente.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una realización es un procedimiento de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino, en adelante procedimiento de la invención.

Los inventores de la presente invención han determinado que el tamaño de la región codificante del gen es de 10383 pb distribuidos en un total de 64 exones.

La secuencia codificante del mARN (CDS) del gen RELN ha sido depositada por los inventores de la presente invención en GenBank con fecha 07/02/2013, obteniéndose para ella el número de acceso KC590614.

El fragmento de ADN identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1 corresponde a una deleción de 31 pb entre las posiciones 5.410 y 5.440 de la secuencia codificante del mARN del gen RELN ovino antes referida (GenBank Acc. no KC590614) , correspondiente a las posiciones 44752377 y 44752407 pb en la secuencia de ADN del genoma ovino (Oarv3.1) , en el exón 36 del gen. Esta deleción se ha identificado por primera vez en la presente invención como responsable de la lisencefalia con hipoplasia cerebelar en oveja, mediante un estudio comparado de la secuencia codificante de este gen en animales enfermos y sanos.

El procedimiento de la invención permite detectar individuos sanos portadores de la enfermedad. Dichos portadores serán heterocigotos para la deleción de 31 pb localizada en el exón 36 del gen, es decir tendrán una copia del gen completa y otra copia portadora de la delecion.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha detección se realiza con un biosensor o microarray.

Otra realización es el procedimiento de la invención, que comprende:

(a) amplificar por PCR en dicha muestra biológica un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80 % respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3,

(b) determinar el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y

(c) realizar un diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar a partir de la información obtenida en el paso (b) .

En la presente solicitud, dicho porcentaje de identidad en una secuencia determinada se calcula teniendo en cuenta que un 80% de identidad significa que un 80% de residuos de la secuencia completa de los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3 son idénticos a los residuos de la secuencia determinada.

Otra realización es el procedimiento de la invención, en el que antes de la etapa (a) se realiza una extracción de ADN de dicha muestra biológica.

La extracción del ADN a partir de estas muestras se puede realizar por métodos como el fenol-cloroformo descrito en Sambrook, 1989 (Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laborator y Manual. 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor Laborator y Press) ; por el método “Salting out” descrito en Miller, 1988 (Miller, S.A. et al, 1988. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic acids research, 16 (3) , pp. 1215) en el caso del semen o la utilización de Chelex-100 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) para la extracción a partir de muestras de pelo. La extracción del ADN también se puede realizar utilizando Kits comerciales de extracción de ADN, sobre todo para muestras de saliva o de muestras de flujo nasal en las que se parte de una escasa cantidad de células nucleadas.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha identidad de secuencia es de al menos 90%.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dichos cebadores están identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha muestra biológica está seleccionada del grupo compuesto por pelo, tejido, célula o fluido biológico.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicho fluido biológico está seleccionado del grupo compuesto por saliva, leche, suero, plasma sanguíneo, sangre, semen y fluido nasal.

Otra realización es un kit para realizar el procedimiento de la invención, que comprende los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

El procedimiento de la invención constituye un método sencillo, rápido y económico de detección de animales portadores, evitando que animales heterocigotos puedan seleccionarse para reposición en el rebaño y ser incluidos en el programa de mejora correspondiente, hechos que favorecerían la diseminación de la enfermedad.

El procedimiento de la invención puede utilizarse también para la detección de animales portadores en el caso de cruzamientos programados para obtener animales que sirvan como modelo animal en el estudio de la enfermedad.

El procedimiento de la invención puede aplicarse a corderos que presenten síntomas nerviosos compatibles con la enfermedad con el fin de descartarla sin necesidad de realizar una necropsia. Otras enfermedades con síntomas similares son la colibacilosis nerviosa, que en corderos recién nacidos produce delgadez y ataxia.

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS A continuación se aporta una traducción del texto libre en inglés que aparece en la lista de secuencias.

SEQ ID NO: 1. Fragmento de deleción del gen ovino RELN. SEQ ID NO: 2. Cebador sentido para PCR. SEQ ID NO: 3. Cebador antisentido para PCR. SEQ ID NO: 4. Fragmento del gen salvaje ovino RELN. 188..365 Exón 36 277..307 Fragmento de deleción SEQ ID NO: 5. Fragmento del gen ovino RELN resultante de la deleción. 188..334 Exón 36

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Se muestran los resultados...

1. Procedimiento de diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar en ganado ovino que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen RELN ovino, identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende:

(a) amplificar por PCR en dicha muestra biológica un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80 % respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3,

(b) determinar el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y

(c) realizar un diagnóstico de lisencefalia con hipoplasia cerebelar a partir de la información obtenida en el paso 10 (b) .

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que antes de la etapa (a) se realiza una extracción de ADN de dicha muestra biológica.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha identidad de secuencia es de al menos 90%.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que dichos cebadores están identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha detección se realiza con un biosensor o microarray.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicha muestra biológica 20 está seleccionada del grupo compuesto por pelo, tejido, célula o fluido biológico.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que dicho fluido biológico está seleccionado del grupo compuesto por saliva, leche, suero, plasma sanguíneo, sangre, semen y fluido nasal.

9. Kit para realizar el procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

SEQUENCE LISTING

<110> UNIVERSIDAD DE LEÓN

<120> PROCEDIMIENTO Y KIT DE DIAGNÓSTICO DE LISENCEFALIA CON HIPOPLASIA CEREBELAR EN GANADO OVINO

<130> P3745/2013

<160> 5

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<221> source <222> 1..31

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Ovine RELN gene deletion fragment"/organism="Artificial Sequence"

<400> 1 gatgtaagtt cccattgaaa tcatctttaa g 31

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<221> source <222> 1..20

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Sense PCR primer"/organism="Artificial Sequence"

<400> 2 ttgccttctc cggtttaatg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<221> source <222> 1..20

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Antisense PCR primer"/organism="Artificial Sequence"

<400> 3

agggatttgt gatgctggac 20

<210> 4

<211> 498

<212> DNA

<213> Ovis aries <220>

<221> source <222> 1..498

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Wild type ovine RELN gene fragment"/organism="Ovis aries"

<220>

<221> exon <222> 188..365

<223> /note="Exon 36"

<220>

<221> variation <222> 277..307

<223> /note="Deletion fragment"

<400> 4 ttgccttctc cggtttaatg cccaagtgat cataaaaaat gatctcagtc gatataagag 60

gaaacatgat atgtgttaga agacagtaac agtatataca ataatatatc atctgaacag 120

aaatgtatct atgtggagca ttgagaaaag acaggaattt cagtgctagt gaacagtctt 180

atctgacccc tttaaaaatg agcgatgttc cagacttgat ggtttcacca ttcagattcc 240

ccctctctgc accatacact tcaggccaaa ggtcgggatg taagttccca ttgaaatcat 300

ctttaagaat cgagggtaga ggaataacag gaacacagta ggctccacca aagccccggt 360

cacacctaag gaaaaaaatg agtggagaaa aggcattata tgtcatgaga tcaagatact 420

atctttcttt ttgcattaca aaaaaagaaa ctgccaattt cattaactta cacacagcgt 480

ccagcatcac aaatccct 498

<210> 5

<211> 467

<212> DNA

<213> Ovis aries <220>

<221> source <222> 1..467

<223> /mol_type="unassigned DNA"/note="Ovine RELN gene fragment resulting from deletion"/organism="Ovis aries"

<220>

<221> exon <222> 188..334

<223> /note="Exon 36"

<400> 5 ttgccttctc cggtttaatg cccaagtgat cataaaaaat gatctcagtc gatataagag 60 gaaacatgat atgtgttaga agacagtaac agtatataca ataatatatc atctgaacag 120 aaatgtatct atgtggagca ttgagaaaag acaggaattt cagtgctagt gaacagtctt 180 atctgacccc tttaaaaatg agcgatgttc cagacttgat ggtttcacca ttcagattcc 240 ccctctctgc accatacact tcaggccaaa ggtcggaatc gagggtagag gaataacagg 300 aacacagtag gctccaccaa agccccggtc acacctaagg aaaaaaatga gtggagaaaa 360 ggcattatat gtcatgagat caagatacta tctttctttt tgcattacaa aaaaagaaac 420 tgccaatttc attaacttac acacagcgtc cagcatcaca aatccct 467