Polipéptidos inmunogénicos de mycoplasma hyopneumoniae.

Un polipéptido inmunogénico purificado con una longitud de 8 a 30 aminoácidos,

cuya secuencia de aminoácidoscomprende al menos ocho residuos consecutivos de la secuencia de SEQ ID NO: 8 ó un mutante de dichopolipéptido inmunogénico, donde dicho mutante tiene una variación conservativa de aminoácido en comparación conel polipéptido de tipo natural y donde el polipéptido mutante retiene la inmunogenicidad.

Polipéptidos inmunogénicos de mycoplasma hyopneumoniae

Antecedentes 1. Campo técnico En la presente memoria se describen los métodos y materiales implicados en la protección de un animal contra neumonía enzoótica.

2. Información sobre antecedentes La neumonía enzoótica en cerdos, también denominada neumonía micoplasmática, está provocada por Mycoplasma hyopneumoniae. La enfermedad es crónica y no fatal, afectando a cerdos de todas las edades. Aunque los cerdos infectados muestran únicamente síntomas ligeros de tos y fiebre, la enfermedad tiene un impacto económico significativo debido a una reducción de la eficacia de la alimentación y una reducción de la ganancia de peso. La neumonía enzoótica se transmite a través de organismos transportados por el aire expelidos de los pulmones de los cerdos infectados. La infección primaria de M. hyopneumoniae puede venir seguida de una infección secundaria de otras especies de Mycoplasma, p. ej., Mycoplasma hyorhinis y Mycoplasma flocculare, así como de otros patógenos bacterianos.

La M. hyopneumoniae infecta los conductos respiratorios de los cerdos, colonizando la tráquea, los bronquios y los bronquiolos. El patógeno produce un factor ciliostático que hace que los cilios que recubren los pasillos respiratorios dejen de moverse. Finalmente, los cilios degeneran, dejando a los cerdos con propensión a infecciones de patógenos secundarios. En los cerdos infectados se observan lesiones características de áreas de consolidación de color púrpura a gris. Muestreos en cerdos llevados a matadero revelaron lesiones en entre el 30% y el 80%. Los resultados de 37 piaras de 13 estados indicaron que el 99% de las piaras tenía cerdos con lesiones de neumonía típicas de la neumonía enzoótica. Por lo tanto, existe una necesidad por medidas efectivas preventivas y de tratamiento.

Los Mycoplasmas varían su estructura superficial mediante una serie compleja de eventos genéticos para presentar un mosaico estructural al sistema inmune del hospedante. El cambio de fase de las moléculas superficiales se produce a través de una variedad de mecanismos tales como cambios en el número de unidades repetitivas durante la replicación de ADN, inversiones genómicas, eventos de transposición y/o conversión génica. Véase, por ejemplo, Zhang y Wise, 1997, Mol. Microbiol., 25: 859-69; Theiss y Wise, 1997, J. Bacteriol., 179: 4013-22; Sachse et al., 2000, Infect. Immun., 68: 680-7; Dybvig y Uy, 1994, Mol. Microbiol., 12: 547-60; y Lysnyansky et al., 1996, J. Bacteriol., 178: 5395-5401. Todos los genes identificados de variable de fase y cambio de fase en micoplasmas que codifican para proteínas superficiales son lipoproteínas.

Sumario Se describen materiales y métodos para proteger un animal de la neumonía enzoótica. Se han descubierto ácidos nucleicos de Mycoplasma hyopneumoniae que codifican polipéptidos de superficie celular que pueden usarse para inducir una respuesta inmune protectora en un animal susceptible a la neumonía. Más específicamente, se describen polipéptidos inmunogénicos purificados de estos polipéptidos para uso como antígenos para provocar una respuesta inmune en un animal, p. ej. un cerdo. Adicionalmente, se describen ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos inmunogénicos para uso en la generación de una respuesta inmune en un animal. Los polipéptidos purificados y aislados descritos en la presente memoria pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables para introducirlos en un animal. Se discuten los materiales y métodos para determinar si un animal tiene un anticuerpo reactivo a los polipéptidos descritos en la presente memoria.

En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido inmunogénico purificado de 8 a 30 aminoácidos de longitud, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos ocho residuos consecutivos de una secuencia de SEQ ID NO:

8.

En otro aspecto, la invención proporciona mutantes del polipéptido inmunogénico descrito anteriormente, donde dichos polipéptidos mutantes retienen la inmunogenicidad y presentan una variación de aminoácido conservativa en comparación con el polipéptido natural.

Los polipéptidos inmunogénicos y los polipéptidos inmunogénicos mutantes de la invención incluyen al menos 8 residuos consecutivos (p. ej., al menos 10, 12, 15, 20 ó 25) de SEQ ID NO: 8.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que incluye uno o más de los polipéptidos inmunogénicos o de los polipéptidos inmunogénicos mutantes de la invención descritos anteriormente.

En un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende los polipéptidos inmunogénicos o los polipéptidos inmunogénicos mutantes descritos anteriormente de la invención para uso en provocar una respuesta inmune en un animal. Dicha composición puede administrarse oralmente, intranasalmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente o intravenosamente. Un animal representativo en el que se pueden introducir las composiciones de la invención es un cerdo.

En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de 8 a 30 aminoácidos de longitud, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos ocho residuos consecutivos de una secuencia de SEQ ID NO: 8 ó un mutante del polipéptido inmunogénico en el que el mutante presenta una variación de aminoácido conservativa en comparación con el polipéptido natural, y en el que el polipéptido mutante retiene la inmunogenicidad. Un ácido nucleico representativo que codifica dichos polipéptidos inmunogénicos presenta una secuencia de nucleótidos que es un fragmento de SEQ ID NO: 7.

La invención también proporciona un vector que contiene un ácido nucleico de la invención. Un vector puede incluir además una secuencia de control de expresión ligada operativamente al ácido nucleico. La invención proporciona adicionalmente células hospedantes que comprenden dichos vectores. La invención además proporciona una composición que incluye dichos vectores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona una composición de la invención para uso en provocar una respuesta inmune en un animal. Dichas composiciones se pueden administrar oralmente, intranasalmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente o intravenosamente. Generalmente, el animal es un cerdo.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un método para determinar si un animal tiene un anticuerpo reactivo frente a un polipéptido inmunogénico de la invención o no, comprendiendo dicho método: poner en contacto una muestra de ensayo procedente de dicho animal con el polipéptido inmunogénico en condiciones permisibles para la unión específica del polipéptido inmunogénico con el anticuerpo; y detectar la presencia o la ausencia de la unión específica, donde la presencia de unión específica indica que el animal tiene el anticuerpo, y la ausencia de la unión específica indica que el animal no tiene el anticuerpo.

Generalmente, una muestra de ensayo apropiada es un fluido biológico tal como sangre, fluido nasal, fluido de la garganta o fluido pulmonar. En algunas realizaciones, el polipéptido inmunogénico está unido a un soporte sólido tal como una placa de microtitulación, o bolitas de poliestireno. En algunas realizaciones, el polipéptido inmunogénico es marcado. A modo de ejemplo, la etapa de detección puede ser mediante radioinmunoensayo (RIA) , inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) .

En otro aspecto, la invención proporciona un kit de diagnóstico para detectar la presencia de un anticuerpo en una muestra de ensayo, donde dicho anticuerpo reacciona con un polipéptido inmunogénico de la invención, comprendiendo dicho kit uno o más de los polipéptidos inmunogénicos de la invención.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado entendido habitualmente por los especialistas en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o en la evaluación de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen más adelante. En caso de conflicto, la presente especificación, que incluye definiciones, será la que controle. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretender ser limitantes.

A partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones, se harán evidentes... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido inmunogénico purificado con una longitud de 8 a 30 aminoácidos, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos ocho residuos consecutivos de la secuencia de SEQ ID NO: 8 ó un mutante de dicho polipéptido inmunogénico, donde dicho mutante tiene una variación conservativa de aminoácido en comparación con el polipéptido de tipo natural y donde el polipéptido mutante retiene la inmunogenicidad.

2. El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos 10 residuos consecutivos de una secuencia de SEQ ID NO: 8.

3. El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos 12 residuos consecutivos de una secuencia de SEQ ID NO: 8.

4. El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos 15 residuos consecutivos de una secuencia de SEQ ID NO: 8.

5. El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos 20 residuos consecutivos de una secuencia de SEQ ID NO: 8.

6. El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos 25 residuos consecutivos de una secuencia de SEQ ID NO: 8.

7. Una composición que comprende el polipéptido inmunogénico o el mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un ácido nucleico aislado que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 8, donde dicha secuencia de nucleótidos es un fragmento de SEQ ID NO: 7.

10. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 8 ó 9.

11. El vector de la reivindicación 10, donde dicho ácido nucleico está ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión.

12. Una célula hospedante que comprende el vector de la reivindicación 10 u 11.

13. Una composición que comprende el vector de la reivindicación 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. La composición de la reivindicación 7 ó 13 para uso en la activación de una respuesta inmune en un animal.

15. La composición de la reivindicación 14, donde dicha composición es para administración oral, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o intravenosa.

16. La composición de la reivindicación 14 ó 15, donde dicho animal es un cerdo.

17. Un polipéptido inmunogénico purificado como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como un antígeno para activar una respuesta inmune en un animal.

18. Un ácido nucleico como el reivindicado en la reivindicación 8 ó 9 para uso en la generación de una respuesta inmune.

19. Un método para determinar si un animal tiene o no un anticuerpo reactivo con el polipéptido inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho método:

poner en contacto una muestra de ensayo procedente de dicho animal con dicho polipéptido inmunogénico en condiciones que permitan la unión específica de dicho polipéptido inmunogénico con dicho anticuerpo; y

detectar la presencia o la ausencia de dicha unión específica, donde dicha presencia de unión específica indica que dicho animal tiene dicho anticuerpo, y donde dicha ausencia de unión específica indica que dicho animal no tiene dicho anticuerpo.

20. El método de la reivindicación 19, donde dicha muestra de ensayo es un fluido biológico.

21. El método de la reivindicación 20, donde dicho fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, fluido nasal, fluido de garganta y fluido pulmonar.

22. El método de la reivindicación 19, donde dicho polipéptido inmunogénico está unido a un soporte sólido.

23. El método de la reivindicación 22, donde dicho soporte sólido es una placa de microtitulación, o bolitas de poliestireno.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, donde dicho polipéptido inmunogénico está marcado.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, donde dicha detección es por radioinmunoensayo (RIA) , inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) .

26. Un kit diagnóstico para detectar la presencia de un anticuerpo en una muestra de ensayo, donde dicho anticuerpo es reactivo con el polipéptido inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho kit el polipéptido inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.