Polinucleótidos modificados para reducir los efectos no específicos en la interferencia con ARN.

Un ARNip de doble hebra que comprende:

i. a hebra efectora que comprende

a.

un primer nucleótido efector terminal 5', en donde dicho primer nucleótido efector terminal 5' comprende una primera modificación 2'-O-alquilo, y

b. un segundo nucleótido efector terminal 5', en donde dicho segundo nucleótido efector terminal 5' comprende una segunda modificación 2'-O-alquilo; y

ii. una hebra antisentido que comprende

a. un primer nucleótido antisentido terminal 5', en donde dicho primer nucleótido antisentido terminal 5' tiene uno o más grupos fosfato anclados al carbono 5' de su radical azúcar, y

b. un segundo nucleótido antisentido terminal 5', en donde dicho segundo nucleótido antisentido terminal 5' comprende una tercera modificación 2'-O-alquilo,

en donde dicha hebra efectora y dicha hebra antisentido son capaces de formar un dúplex de 18-19 pares de bases de nucleótidos que tiene una complementariedad de 100% a lo largo del intervalo del dúplex, y dentro de dicho dúplex dicho primer nucleótido efector terminal 5' es el nucleótido más 5' de la hebra efectora, dicho segundo nucleótido efector terminal 5' es inmediatamente adyacente y está aguas abajo del primer nucleótido efector terminal 5', dicho primer nucleótido antisentido terminal 5' es el nucleótido más 5' de la hebra antisentido y dicho segundo nucleótido antisentido terminal 5' es inmediatamente adyacente y está aguas abajo del primer nucleótido antisentido terminal 5', en donde todos los nucleótidos de la hebra efectora y la hebra antisentido distintos de dicho primer nucleótido efector terminal 5', dicho segundo nucleótido efector terminal 5', y dicho segundo nucleótido antisentido terminal 5' comprenden un 2'-OH.

Polinucleótidos modificados para reducir los efectos no específicos en la interferencia con ARN

Campo de la invención La presente invención hace referencia al campo de los polinucleótidos modificados.

Antecedentes Actualmente se cree que la inactivación de genes mediante el silenciamiento de genes inducido por ARN implica un mínimo de tres niveles diferentes de control: (i) inactivación de la transcripción (ADN guiado por ARNip y metilación de histonas) ; (ii) degradación de ARNm inducida por ARN de interferencia pequeño (ARNip) ; y (iii) atenuación transcripcional inducida por ARNip. El ARN de interferencia (ARNi) generado por ARNip puede tener una larga duración y ser eficaz a lo largo de múltiples divisiones celulares. Por lo tanto, el ARNi representa una herramienta potencialmente valiosa que puede ser útil en el análisis de la función de los genes, la validación de la diana del fármaco, el análisis de rutas, y la terapia de enfermedades.

Recientes estudios en el mecanismo de la ruta de degradación del transcrito mediada por ARNi han revelado numerosos componentes claves en esta ruta. Una ARNasa de tipo II denominada Dicer procesa el ARNdh largo en ARNip (dúplex de 19-23 pb) que con posterioridad se empareja con el Complejo de Silenciamiento de Interferencia con ARN (RISC) para mediar la degradación de transcritos diana de una manera específica de la secuencia. Este fenómeno se ha observado en un grupo diverso de organismos. Desafortunadamente, los intentos iniciales para utilizar ARNdh largo para inducir ARNi en células de mamífero alcanzó un éxito apenas limitado debido a la inducción de la respuesta del interferón, lo que da como resultado una inhibición general, en oposición a la dirigida, de la síntesis de proteína.

Más recientemente, se ha demostrado que cuando los ARNip sintéticos cortos son introducidos en células de mamífero en cultivo, se puede lograr una degradación específica de la secuencia del ARNm diana sin inducir una respuesta de interferón. Estos dúplex cortos, pueden actuar catalíticamente a concentraciones sub-molares para escindir más de 95% del ARNm diana en una célula. Se proporciona una descripción de los mecanismos para la actividad del ARNip, así como de algunas de sus aplicaciones en Provost et al., Ribonuclease Activity and RNA Binding of Recombinant Human Dicer, E.M.B.O.J., 2002 Nov., 1, 21 (21) : 5864 -5874;Tabara et al., The dsRNA Binding Protein RDE-4 Interacts with RDE-1, DCR-1 and a DexH-box Helicase to Direct RNAi in C. elegans, Cell 2002, 28 Junio, 109 (7) :861-71; Ketting et al., Dicer Functions in RNA Interference and in Synthesis of Small RNA Involved in Developmental Timing in C. elegans, Genes and Development, 2001, 15 (20) :2654-9; y Martinez et al., Single-Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNA, Cell 2002, 6 Sept., 110 (5) :563.

A pesar de la promesa del ARNi, se deben tratar cuatro cuestiones principales incluyendo funcionalidad, especificidad, métodos de liberación, y estabilidad, cuando se trabaja con ARNip. La especificidad hace referencia a la capacidad de un ARNip concreto para silenciar una diana deseada sin alterar la expresión de otros genes, y estudios recientes han demostrado que la inhibición de un gen distinto del deseado ("off-targeting", esto es, la inhibición de dianas distintas de la diana pretendida) es mucho más extensa en el ARNi de lo que originalmente se pronosticó (véase Jackson, A.L. et al. (2003) "Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi" Nature Biotechnology 21:635-7) .

Puesto que los efectos no específicos puede inducir fenotipos no deseables, se consideran indispensables nuevos métodos y composiciones que minimicen, alteren, o eliminen los efectos no específicos para que el ARNip se convierta en una herramienta de investigación y terapéutica eficaz. La presente invención aborda la cuestión de la especificidad proporcionando modificaciones para el ARNip que pueden incrementar o alterar la especificidad del ARNip.

Compendio de la invención La presente invención está dirigida a composiciones y métodos para realizar la interferencia por ARN. En general las modificaciones químicas por ARNip descritas en la presente memoria afectan a una propiedad crítica de las moléculas: la especificidad. Las modificaciones que afectan a la especificidad son particularmente ventajosas en aplicaciones de investigación y terapéuticas donde la especificidad es crítica. Se describe una combinación distinta de modificaciones (y derivados de ese patrón de modificación) que mejora sustancialmente las aplicaciones del ARNi y que es aplicable en el diseño de reactivos de silenciamiento óptimos.

Por consiguiente, la invención proporciona: Un ARNip de doble hebra que comprende:

i. una hebra efectora que comprende

a. un primer nucleótido efector terminal 5', en donde dicho primer nucleótido efector terminal 5' comprende una primera modificación 2'-O-alquilo, y

b. un segundo nucleótido efector terminal 5', en donde dicho segundo nucleótido efector terminal 5' comprende una segunda modificación 2'-O-alquilo; y

ii. una hebra antisentido que comprende

a. un primer nucleótido antisentido 5' terminal, en donde dicho primer nucleótido antisentido terminal 5' tiene uno o más grupos fosfato unidos al carbono 5' de su radical azúcar, y

b. un segundo nucleótido antisentido terminal 5', en donde dicho segundo nucleótido antisentido 5' terminal comprende una tercera modificación 2'-O-alquilo,

en donde dicha hebra efectora y dicha hebra antisentido son capaces de formar un dúplex de 18-19 pares de bases de nucleótidos que tiene una complementariedad de 100% a lo largo del intervalo del dúplex, y dentro de dicho primer nucleótido efector terminal 5' es el nucleótido más 5' de la hebra efectora, dicho segundo nucleótido efector terminal 5' es inmediatamente adyacente y está aguas abajo del primer nucleótido efector terminal 5', dicho primer nucleótido antisentido terminal 5' es el nucleótido más 5' de la hebra antisentido y dicho segundo nucleótido antisentido 5' terminal es inmediatamente adyacente y está aguas abajo del primer nucleótido antisentido terminal 5', en donde todos los nucleótidos de la hebra efectora y de la hebra antisentido distintos de dicho primer nucleótido efector terminal 5', dicho segundo nucleótido efector terminal 5', y dicho segundo nucleótido antisentido 5' terminal comprenden un 2'-OH.

La invención también proporciona un ARNip de doble hebra de la invención para su uso en el tratamiento del organismo humano o animal mediante terapia o para su uso en un método de diagnóstico que se pone en práctica en un organismo humano o animal.

Breve descripción de las figuras Las ventajas de las realizaciones preferidas de ciertos aspectos de la invención se muestran en las figuras adjuntas, en donde: La Figura 1 representa la relación entre el posicionamiento de una realización de las modificaciones de la invención en dúplex que son más largos de 25 pb. El diseño óptimo de las moléculas garantiza que después de la digestión con Dicer, el dúplex funcional final contiene el patrón de modificación de la invención representado. Obsérvese, en el sustrato de Dicer inicial, que la hebra efectora y/o antisentido pueden tener salientes 3'. Alternativamente, ambos extremos pueden tener extremos romos. La Figura 2 representa la relación entre el posicionamiento de las modificaciones de la invención en horquillas. El diseño óptimo de las moléculas garantiza que después de la digestión con Dicer, el dúplex funcional final contiene el patrón de modificación de la invención representado. Obsérvese, en el sustrato de Dicer inicial, que el extremo libre (abierto) de la molécula puede ser romo o puede contener un saliente 3'. Además, la molécula unimolecular se puede organizar en orientación 5' antisentido-bucle-efecto o 5' efectorbucle-antisentido. La Figura 3 ilustra un esbozo del ciclo de síntesis de ARN 2'-ACE. La Figura 4 ilustra la estructura de un ARN protegido con 2'-ACE preferido inmediatamente antes de la desprotección 2'. Las Figuras 5A y 5B representan la relación entre la modificación y la función para ARNip SEAP-2217 2'-Ometilado. Las figuras demuestran el efecto sobre el silenciamiento génico de modificaciones de una sola base (barras de color negro) y emparejadas (gris) 2'-O-metil de la hebra efectora (Figura 5A) and hebra antisentido (Figura 5B) of SEAP-2217. El eje de las X representa la relación positiva de la modificación junto con cada hebra de ARNip (5'→3') . El eje de las Y representa el porcentaje de expresión con respecto a los controles. Las Figuras 6A-6F muestran los efectos de la 2'-O-metilación con y sin fosforilación... [Seguir leyendo]

1. Un ARNip de doble hebra que comprende:

i. a hebra efectora que comprende

a. un primer nucleótido efector terminal 5', en donde dicho primer nucleótido efector terminal 5' comprende una primera modificació.

2. O-alquilo, y

b. un segundo nucleótido efector terminal 5', en donde dicho segundo nucleótido efector terminal 5' comprende una segunda modificació.

2. O-alquilo; y

ii. una hebra antisentido que comprende

a. un primer nucleótido antisentido terminal 5', en donde dicho primer nucleótido antisentido terminal 5' tiene uno o más grupos fosfato anclados al carbono 5' de su radical azúcar, y

b. un segundo nucleótido antisentido terminal 5', en donde dicho segundo nucleótido antisentido terminal 5' comprende una tercera modificació.

2. O-alquilo,

en donde dicha hebra efectora y dicha hebra antisentido son capaces de formar un dúplex de 18-19 pares de bases de nucleótidos que tiene una complementariedad de 100% a lo largo del intervalo del dúplex, y dentro de dicho dúplex dicho primer nucleótido efector terminal 5' es el nucleótido más 5' de la hebra efectora, dicho segundo nucleótido efector terminal 5' es inmediatamente adyacente y está aguas abajo del primer nucleótido efector terminal 5', dicho primer nucleótido antisentido terminal 5' es el nucleótido más 5' de la hebra antisentido y dicho segundo nucleótido antisentido terminal 5' es inmediatamente adyacente y está aguas abajo del primer nucleótido antisentido terminal 5', en donde todos los nucleótidos de la hebra efectora y la hebra antisentido distintos de dicho primer nucleótido efector terminal 5', dicho segundo nucleótido efector terminal 5', y dicho segundo nucleótido antisentido terminal 5' comprenden u.

2. OH.

2. El ARNip de doble hebra de la reivindicación 1, en donde dicha primera modificació.

2. O-alquilo comprend.

2. Ometilo, dicha segunda modificació.

2. O-alquilo comprend.

2. O-metilo, y dicha tercera modificació.

2. O-alquilo comprend.

2. O- metilo.

3. El ARNip de doble hebra de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un saliente 3' de 1 a 6 bases en al menos una de dicha hebra efectora y dicha hebra antisentido.

4. Un ARNip de doble hebra como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento del organismo humano o animal mediante terapia o para su uso en un método de diagnóstico que se pone en práctica en el organismo humano o animal.