Polímeros recombinantes no estructurados y usos de los mismos.

Un procedimiento de aumento de la semivida en suero de una proteina,

que comprende:

fusionar dicha proteina con uno o mas polimeros recombinantes no estructurados (URP), en el que el URP comprende al menos aproximadamente 200 aminoacidos contiguos, y en el que

(a) la suma de los residuos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina

(P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y

(b) al menos el 50% de los aminoacidos del URP no estan presentes en la estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman; y en el que dicho URP es sustancialmente incapaz de unirse no especificamente a una proteina del suero; y

(c) el URP tiene una puntuacion de epitope T igual a o inferior a -4.

Polimeros recombinantes no estructurados y usos de los mismos

REFERENCIA CRUZADA ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Se ha documentado bien que las propiedades de proteinas, en particular eliminacion del plasma e inmunogenicidad, pueden mejorarse uniendo polimeros hidrofilos a estas proteinas (Kochendoerfer, G. (2003) Expert Opin Biol Ther, 3: 1253-61) , (Greenwald, R. B. y col. (2003) Adv Drug Deliv Rev, 55: 217-50) , (Harris, J. M. y col. (2003) Nat Rev Drug Discov, 2: 214-21) . Ejemplos de proteinas modificadas con polimeros que han sido autorizada por la FDA para el tratamiento de pacientes son Adagen, Oncaspar, PEG-Intron, Pegasys, Somavert y Neulasta. Muchas mas proteinas modificadas con polimeros estan en ensayos clinicos. Estos polimeros ejercen su efecto aumentando el radio hidrodinamico (tambien llamado radio de Stoke) de la proteina modificada con respecto a la proteina sin modificar, que reduce la tasa de eliminacion por filtracion del rifon (Yang, K. y col. (2003) Protein Eng, 16: 761-70) . Ademas, la union del polimero puede reducir la interaccion de la proteina modificada con otras proteinas, celulas o superficies. En particular, la union del polimero puede reducir interacciones entre la proteina modificada y anticuerpos y otros componentes del sistema inmunitario, reduciendo asi la formacion de una respuesta inmunitaria del huesped a la proteina modificada. Es de particular interes la modificacion de proteinas por PEGilacion, es decir, uniendo polimeros lineales o ramificados de polietilenglicol. Se mostro inmunogenicidad reducida tras la PEGilacion, por ejemplo, para fenilalanina amoniaco liasa (Gamez, A. y col. (2005) Mol Ther, 11: 986-9) , anticuerpos (Deckert, P. M. y col. (2000) Int J Cancer, 87: 382-90.) , estafilocinasa (Collen, D. y col. (2000) Circulation, 102: 1766-72) y hemoglobina (Jin, C. y col. (2004) Protein Pept Lett, 11: 353-60) . Normalmente, tales polimeros se conjugan con la proteina de interes mediante una etapa de modificacion quimica despues de que se haya purificado la proteina sin modificar. [0002] Pueden unirse diversos polimeros a proteinas. Son de particular interes polimeros hidrofilos que tienen conformaciones flexibles y se hidratan bien en disoluciones acuosas. Un polimero frecuentemente usado es polietilenglicol (PEG) . Estos polimeros tienden a tener grandes radios hidrodinamicos con respecto a su peso molecular (Kubetzko, S. y col. (2005) Mol Pharmacol, 68: 1439-54) . Los polimeros unidos tienen a tener interacciones limitadas con la proteina a la que se han unido y asi la proteina modificada con polimero retiene sus funciones relevantes.

La conjugacion quimica de polimeros con proteinas requiere complejos procedimientos de multiples etapas. Normalmente, el componente de proteina necesita producirse y purificarse antes de la etapa de conjugacion quimica. La etapa de conjugacion puede producir la formacion de mezclas de productos que necesitan separarse, conduciendo a una perdida significativa de producto. Alternativamente, tales mezclas pueden usarse como producto farmaceutico final. Algunos ejemplos son productos de interferon-alfa PEGilados actualmente comercializados que se usan como mezclas (Wang, B. L. y col. (1998) J Submicrosc Cytol Pathol, 30: 503-9; Dhalluin, C. y col. (2005) Bioconjug Chem, 16: 504-17) . Tales mezclas son dificiles de fabricar y caracterizar y contienen isomeros con actividad reducida o no terapeutica. [0004] Se han descrito procedimientos que permiten la adicion especifica para sitio de polimeros como PEG.

Ejemplos son la PEGilacion selectiva en un unico sitio de glicosilacion de la proteina diana o la PEGilacion selectiva de un aminoacido no natural que ha sido manipulado en las proteinas diana. En algunos casos ha sido posible PEGilar selectivamente el extremo N de una proteina, a la vez que se evita la PEGilacion de cadenas laterales de lisina en la proteina diana controlando cuidadosamente las condiciones de reaccion. Todavia otro enfoque para la PEGilacion especifica para sitio de proteinas diana es la introduccion de residuos de cisteina que permiten la 50 conjugacion selectiva. Todos estos procedimientos tienen limitaciones significativas. La PEGilacion selectiva del extremo N requiere un cuidado control del procedimiento y las reacciones secundarias son dificiles de eliminar. La introduccion de cisteinas para la PEGilacion puede interferir con la produccion y/o purificacion de proteinas. La introduccion especifica de aminoacidos no naturales requiere organismos huesped especificos para la produccion de proteinas. Otra limitacion de la PEGilacion es que el PEG se fabrica normalmente como una mezcla de polimeros 55 con longitud similar, pero no uniforme. Las mismas limitaciones son inherentes en muchos otros polimeros quimicos. [0005] La conjugacion quimica usando polimeros multifuncionales que permitirian la sintesis de productos con modulos de multiples proteinas es incluso mas compleja que la conjugacion de polimeros de un dominio de una sola proteina.

Recientemente se ha observado que algunas proteinas de organismos patogenos contienen secuencias de peptidos repetitivas que parece que conducen a una semivida en suero relativamente larga de las proteinas que contienen estas secuencias (Alvarez, P. y col. (2004) J Biol Chem, 279: 3375-81) . Se ha demostrado 5 que secuencias oligomericas que se basan en tales secuencias repetitivas derivadas de patogeno pueden fusionarse con otras proteinas produciendo elevada semivida en suero. Sin embargo, estos oligomeros derivados de patogeno tienen varias deficiencias. Las secuencias derivadas de patogeno tienden a ser inmunogenicas. Se ha descrito que las secuencias pueden modificarse para reducir su inmunogenicidad. Sin embargo, no se ha informado de intentos para eliminar epitopes de linfocitos T de las secuencias que contribuyen a la formacion de reacciones inmunitarias. Ademas, las secuencias derivadas de patogeno no se han optimizado para aplicaciones farmacologicas que requieren secuencias con buena solubilidad y una afinidad muy baja por otras proteinas diana.

Asi, hay una necesidad significativa de composiciones y procedimientos que permitirian que se combinaran modulos de multiples polimeros y modulos de multiples proteinas en productos de multiples dominios definidos.

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente divulgacion describe un polimero recombinante no estructurado (URP) que comprende al

menos 40 aminoacidos contiguos, en el que dicho URP es sustancialmente incapaz de unirse no especificamente a una proteina del suero, y en el que (a) la suma de los residuos de glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y/o (b) al menos el 50% de los aminoacidos carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman. En un realizacion relacionada se describe un polimero recombinante no estructurado (URP) que comprende al menos 40 aminoacidos contiguos, en el que dicho URP tiene una semivida de degradacion en suero in vivo superior a aproximadamente 24 horas, y en el que (a) la suma de los residuos de glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y/o (b) al menos el 50% de los aminoacidos carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman. El

URP objeto puede comprender una secuencia de aminoacidos no naturales. Si se desea, el URP se selecciona para la incorporacion en una proteina heterologa, y en el que tras la incorporacion del URP en una proteina heterologa, dicha proteina heterologa presenta una semivida de secrecion en suero prolongada y/o mayor solubilidad con respecto a la proteina correspondiente que es deficiente en dicho URP. La semivida puede prolongarse dos veces, tres veces, cinco veces, diez veces o mas. En algunos aspectos, la incorporacion del URP en una proteina heterologa produce al menos un aumento de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o mas en el peso molecular aparente de la proteina como se aproxima por cromatografia de exclusion por tamafo. En algunos aspectos, los URP tienen una puntuacion de epitope T inferior a -3, 5 (por ejemplo, -4 o menos, -5 o menos) . En algunos aspectos, los URP pueden contener predominantemente residuos hidrofilos. Si se desea, al menos el 50% de los aminoacidos del URP carecen de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman. Los residuos de glicina contenidos en el URP pueden constituir al menos aproximadamente el 50% de los aminoacidos totales del URP. En algun aspecto, un tipo cualquiera de los aminoacidos solos seleccionados del grupo constituido por glicina (G)... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de aumento de la semivida en suero de una proteina, que comprende:

fusionar dicha proteina con uno o mas polimeros recombinantes no estructurados (URP) , en el que el URP comprende al menos aproximadamente 200 aminoacidos contiguos, y en el que

(a) la suma de los residuos de glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina

(P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 80% de los aminoacidos totales del URP; y

(b) al menos el 50% de los aminoacidos del URP no estan presentes en la estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman; y en el que dicho URP es sustancialmente incapaz de unirse no especificamente a una proteina del suero; y

(c) el URP tiene una puntuacion de epitope T igual a o inferior a -4.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la semivida en suero de la proteina se prolonga al menos 2 veces.

3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el URP comprende una secuencia de aminoacidos no naturales.

4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el URP carece sustancialmente de estructura secundaria como se ha determinado por el algoritmo de Chou-Fasman.

5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que residuos de glicina contenidos en el URP constituyen al menos aproximadamente el 50% de los aminoacidos totales del URP.

6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el URP comprende repeticion de secuencias.

7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la proteina es una proteina farmaceuticamente activa.

8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la proteina comprende uno o mas modulos seleccionados del grupo constituido por modulos de union, modulos efectores, modulos de multimerizacion, modulos del extremo C y modulos del extremo N.

9. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho URP contiene solo 3, 4, 5 o 6 tipos diferentes de aminoacidos seleccionados del grupo constituido por glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) .

10. El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que la proteina farmaceuticamente activa esta seleccionada del grupo constituido por citocinas, factores de crecimiento, enzimas, receptores, microproteinas, hormonas, eritropoyetina, adenosina desiminasa, asparaginasa, arginasa, interferon, hormona de crecimiento, hormona liberadora de hormona de crecimiento, G-CSF, GM-CSM, insulina, hirudina, receptor de TNF, uricasa, rasburicasa, axokine, RNasa, ADNsa, fosfatasa, exotoxina de Pseudomonas, ricina, gelonina, desmoteplasa, laronidasa, trombina, enzima de coagulacion de la sangre, VEGF, protropina, somatropina, alteplasa, interleucina, factor VII, factor VIII, factor X, factor IX, dornasa, glucocerebrosidasa, folitropina, glucagon, tirotropina, nesiritida, alteplasa, teriparatida, agalsidasa, laronidasa, metioninasa.

11. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que un tipo cualquiera de los aminoacidos solos seleccionados del grupo constituido por glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye mas de aproximadamente el 20% o mas de los aminoacidos totales del URP.