Poblaciones celulares mixtas para la reparación de tejidos y técnica de separación para el procesamiento celular.

Método para procesar células en cultivo, que comprende:

proporcionar una biocámara para el cultivo de células,

proporcionar un medio de cultivo para el cultivo de células dentro de la biocámara,

inocular la biocámara con células,

cultivar las células,

tras un periodo de tiempo de cultivo predeterminado, desplazar el medio de cultivo de la biocámara con una primerasolución de enjuague biocompatible,

sustituir la primera solución de enjuague por una solución enzimática de recolección celular seleccionada del grupoconsistente en tripsinas, colagenasas, enzimas de origen microbiano, agentes de disociación, proteasas o mezclasde los mismos; e

incubar el contenido de la biocámara durante un periodo de tiempo predeterminado, en el que durante laincubación, el enzima por lo menos disocia las células unas de otras y/o de la superficie de la biocámara, ydesplazarla solución enzimática con una segunda solución de enjuague, en la que, al desplazar el enzima, la cámara se llenasustancialmente con la segunda solución de enjuague.

Poblaciones celulares mixtas para la reparación de tejidos y técnica de separación para el procesamiento celular

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones de poblaciones celulares mixtas, a su posterior utilización in vivo para la reparación de tejidos y a procedimientos, dispositivos y sistemas para la preparación de poblaciones celulares mixtas. Los procedimientos de la invención también resultan aplicables a la separación de cualquier tipo de célula (adherente, no adherente o una mezcla de las mismas) o partículas pequeñas (por ejemplo del tamaño de una célula) de un líquido o solución que las contiene.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La medicina regenerativa aprovecha, de una manera clínicamente dirigida, la capacidad de las células regenerativas, por ejemplo las células madre y/o las células progenitoras (es decir, las células maestras no especializadas del cuerpo) , de renovarse indefinidamente y desarrollarse para formar células especializadas maduras. Las células madre se encuentran en embriones durante los estadios tempranos del desarrollo, en tejido fetal y en algunos órganos y tejidos adultos. Las células madre embrionarias (en lo sucesivo denominadas "CME") es conocido que se convierten en muchos, si no todos, los tipos celulares y tisulares del cuerpo. Las CME no sólo contienen toda la información genética del individuo, sino que también contienen la capacidad naciente de convertirse en cualquiera de los más de 200 tipos de células y tejidos del cuerpo. De esta manera, estas células presentan un tremendo potencial para la medicina regenerativa. Por ejemplo, las CME pueden crecer para convertirse en tejidos específicos tales como el cardiaco, pulmonar o renal, que después podrían utilizarse para reparar órganos dañados o enfermos. Sin embargo, los tejidos derivados de CME presentan limitaciones clínicas. Debido a que las CME no se derivan necesariamente de otro individuo, es decir, un embrión, existe el riesgo de que el sistema inmunológico del receptor rechace el nuevo material biológico. Aunque se dispone de fármacos inmunosupresores para evitar dicho rechazo, también es conocido que estos fármacos bloquean respuestas inmunológicas deseadas, tales como las que se enfrentan a las infecciones por bacterias y virus.

Además, el debate ético acerca del origen de las CME, es decir, los embriones, está bien documentado y supone un obstáculo adicional, y quizás, insuperable, para el futuro próximo.

Las células madre adultas (en lo sucesivo denominadas intercambiablemente "CMA") representan una alternativa a la utilización de las CME. Las CMA residen silenciosamente en muchos tejidos no embrionarios, presumiblemente a la espera de responder a traumatismos u otros procesos patológicos destructivos, de manera que puedan curar el tejido dañado. En especial los últimos datos científicos indican que cada individuo porta un grupo de CMA que podría compartir con las CME la capacidad de convertirse en muchos, si no todos, los tipos celulares y tisulares. De esta manera, las CMA, al igual que las CME, presentan un tremendo potencial para las aplicaciones clínicas de la medicina regenerativa.

Se ha demostrado la presencia de poblaciones de CMA en uno o más de entre médula ósea, piel, músculo, hígado y cerebro. Sin embargo, la frecuencia de las CMA en estos tejidos es baja. Por ejemplo, la frecuencia de las células madre mesenquimales en la médula ósea se estima en 1 de cada 100.000 y en 1 de cada 1.000.000 de células nucleadas. De esta manera, cualquier propuesta de aplicación clínica de las CMA a partir de dichos tejidos requiere incrementar el número, pureza y madurez de las células mediante procedimientos de purificación y cultivo celulares.

Aunque las etapas de cultivo celular pueden proporcionar un número, pureza y madurez celulares incrementados, lo hacen a un coste. Este coste puede incluir una o más de las dificultades técnicas siguientes: pérdida de la función celular debido al envejecimiento celular, pérdida de poblaciones celulares potencialmente útiles, retrasos en la potencial aplicación de las células en los pacientes, coste monetario incrementado, riesgo incrementado de contaminación de las células con microorganismos ambientales durante el cultivo y necesidad de un procesamiento adicional posterior al cultivo para reducir los materiales de cultivo contenidos con las células recolectadas.

Más concretamente, todos los productos celulares finales deben cumplir los rígidos requisitos impuestos por la Federal Drug Administration (FDA) . La FDA requiere que todos los productos celulares finales minimicen las proteínas "extrañas" que es conocido que pueden producir efectos alergénicos en sujetos humanos, así como que minimicen los riesgos de contaminación. Además, la FDA espera una viabilidad celular mínima del 70% y cualquier procedimiento debería exceder consistentemente este requisito mínimo.

Aunque existen métodos y aparatos para separar las células de los componentes de cultivo disueltos no deseados y una diversidad de aparatos actualmente en uso clínico, dichos métodos y aparatos adolecen de un problema significativo: daños celulares causados por las fuerzas mecánicas aplicadas durante el procedimiento de separación, que se manifiestan, por ejemplo, como una reducción de la viabilidad y función biológica de las células y en un incremento del ADN y los residuos celulares libres. Además, puede producirse una pérdida significativa de células debido a la incapacidad de transferir la totalidad de las células al aparto de separación, así como de extraer todas

las células del aparato. Además, para poblaciones celulares mixtas, dichos métodos y aparatos pueden provocar un desplazamiento del perfil celular debido a la pérdida preferente de subpoblaciones más grandes y más frágiles.

De esta manera, existe una necesidad en el campo de la terapia celular, tal como la reparación de tejidos, la regeneración de tejidos y la manipulación de tejidos, de composiciones celulares que ya estén listas para la administración directa en el paciente con viabilidad y funcionalidad sustancialmente elevadas y con una reducción sustancial de los materiales necesarios para el cultivo y la recolección de las células. Además, existe la necesidad de procedimientos y dispositivos fiables que permitan la producción de dichas composiciones que resulten adecuados para la implementación clínica y comercialización a gran escala de dichas composiciones como productos de terapia celular.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

En la presente memoria se describen composiciones y métodos para la reparación de tejidos. La composición resulta útil para tratar una diversidad de enfermedades y trastornos, tales como las condiciones isquémicas (por ejemplo la isquemia de extremidades, la insuficiencia cardiaca congestiva, la isquemia cardiaca, la isquemia renal y ERET, ictus, e isquemia ocular) , condiciones que requieren la regeneración de órganos o tejidos (por ejemplo la regeneración de hígado, páncreas, pulmón, glándula salival, vaso sanguíneo, hueso, piel, cartílago, tendón, ligamento, cerebro, pelo, riñón, músculo, músculo cardiaco, nervio y extremidades) , enfermedades inflamatorias (por ejemplo enfermedad cardiaca, diabetes, lesión de la médula espinal, artritis reumatoide, osteoartritis, inflamación debido al reemplazo o revisión de cadera, enfermedad de Crohn y enfermedad del injerto contra el huésped) y enfermedades autoinmunológicas (por ejemplo diabetes de tipo 1, soriasis, lupus sistémico y esclerosis múltiple) .

Asimismo, se describe en la presente memoria una composición de células aisladas para la reparación de tejidos que contiene una población mixta de células. Las células se encuentran en una solución de electrolitos de grado farmacéutico adecuada para la administración en el ser humano. Las células se derivan de células mononucleares. Por ejemplo, las células se derivan de médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical o hígado fetal. Las células son de linaje hematopoyético, mesenquimal y endotelial. La viabilidad de las células es de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior. El número total de células viables en la composición es de entre 35 millones y 300 millones y en un volumen inferior a 25 ml, 20 ml, 15 ml, 10 ml, 7, 5 ml, 5 ml o menos. Por lo menos 5% de las células viables en la composición son CD90+. Por ejemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75% o más son CD90+. En algunos aspectos, por lo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 50% o más de las CD90+ coexpresan CD15. Preferentemente, las células son aproximadamente 5% a 75% CD90+ viables, siendo las células restantes... [Seguir leyendo]

1. Método para procesar células en cultivo, que comprende: 5 proporcionar una biocámara para el cultivo de células, proporcionar un medio de cultivo para el cultivo de células dentro de la biocámara,

inocular la biocámara con células,

cultivar las células,

tras un periodo de tiempo de cultivo predeterminado, desplazar el medio de cultivo de la biocámara con una primera 10 solución de enjuague biocompatible,

sustituir la primera solución de enjuague por una solución enzimática de recolección celular seleccionada del grupo consistente en tripsinas, colagenasas, enzimas de origen microbiano, agentes de disociación, proteasas o mezclas de los mismos; e incubar el contenido de la biocámara durante un periodo de tiempo predeterminado, en el que durante la incubación, el enzima por lo menos disocia las células unas de otras y/o de la superficie de la biocámara, y desplazar la solución enzimática con una segunda solución de enjuague, en la que, al desplazar el enzima, la cámara se llena sustancialmente con la segunda solución de enjuague.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la segunda solución de enjuague comprende una solución capaz de 20 inyectarse en un ser humano.

3. Método para procesar células en cultivo según la reivindicación 1, que comprende además: desplazar una parte de la segunda solución de enjuague con un gas con el fin de obtener un volumen reducido predeterminado de líquido en la cámara.

4. Método para procesar células en cultivo según la reivindicación 1, que comprende además agitar la cámara para resuspender las células sedimentadas.

5. Método para procesar células en cultivo según la reivindicación 1, que comprende además drenar la solución con 30 células en suspensión hacia el interior de un recipiente de recolección de células.

6. Método para procesar células en cultivo según la reivindicación 1, que comprende además añadir una cantidad adicional de la segunda solución a la biocámara y agitar la biocámara para enjuagar las células residuales hacia el exterior.

7. Método para procesar células en cultivo según la reivindicación 6, que comprende además drenar la solución hacia el interior de un recipiente de recolección de células.

8. Método según la reivindicación 1, en el que el caudal para la introducción de soluciones y/o gases añadidos a la 40 biocámara es de entre aproximadamente 0, 03 y aproximadamente 1, 0 intercambios de volumen/min.

9. Método según la reivindicación 1, en el que el caudal para la introducción de soluciones y/o gases añadidos a la biocámara es de entre aproximadamente 0, 50 y aproximadamente 0, 75 intercambios de volumen/min.

10. Método según la reivindicación 1, en el que los líquidos/soluciones o gases se introducen en la biocámara según un flujo de pistón radial.

11. Método según la reivindicación 1, en el que dichas células se derivan de células mononucleares.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dichas células mononucleares son de médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical o hígado fetal.

13. Método según la reivindicación 1, en el que dicho cultivo produce una población celular mixta en la que más de 5% de la población celular es CD90+. 55

14. Células en cultivo producidas según el método según la reivindicación 1.

15. Composición que comprende las células en cultivo según la reivindicación 14.