Péptidos antibióticos.

Un péptido con al menos 16 residuos y la fórmula general:**Fórmula**

en donde

X1 es un residuo cargado positivamente;

X2 es un residuo con una cadena lateral polar o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas;

X3 es un radial que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas;

X4 es un reisduo neutro con una cadena lateral polar, preferiblemente no glutamina, o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condicones fisiológicas;

X5 es prolina o un derivado de prolina;siendo Sub1 una modificación del grupo amino N-terminal, en el que la modificación es guanidación;

siendo Sub2 el grupo carboxilo C-terminal libre del aminoácido C-terminal o una modificación del grupo carboxilo C-terminal.

Peptidos antibióticos Esta invención se refiere a nuevos peptidos antibióticos, especialmente para su uso en medicina.

Ademas, la invención se refiere a composiciones y metodos para eliminar microbios, tales como bacterias u hongos, 5 y a los metodos para el tratamiento de infecciones microbianas. La invención se refiere ademas a un metodo para el analisis de escrutinio de farmacos.

La incidencia de las infecciones bacterianas y fungicas graves esta aumentando a pesar de los notables avances en la terapia con antibióticos. Cada ano hay mas de 40 millones de hospitalizaciones en los Estados Unidos, y aproximadamente 2 millones de pacientes adquieren infecciones nosocomiales, de las cuales 50 a 60% implican a 10 bacterias resistentes a los antibióticos [1]. El numero de muertes relacionadas con la enfermedad nosocomial se estima en 60.000-70.000 anualmente en los EE.UU. y hasta 10.000 en Alemania [2]. Si bien las bacterias Gramnegativas resistentes fueron un problema importante en la decada de 1970, la ultima decada ha visto un ascenso en el numero de incidentes con cepas Gram-positivas resistentes a multiples farmacos [3]. Actualmente, la rapida aparición de cepas resistentes implica tanto a patógenos Gram-positivos como Gram-negativos [4]. La resistencia se 15 desarroll6 primero en las especies en las que las eran suficientes mutaciones individuales para ocasionar niveles clinicamente importantes, tales como Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, seguido por las bacterias en la que se requieren multiples mutaciones, tales como E. coli y Neisseria gonorrea. Esto se debe principalmente a la amplia utilización de fluoroquinolonas [5]. Las causas importantes de la resistencia de los Gram-negativos incluyen las lactamasas de amplio espectro en Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae [6]. Casi la mitad de las cepas clinicas de Haemophilus ducreyi, el agente causante del chancroide, porta los genes que confieren resistencia a amoxicilina, ampicilina y una serie de otras º-lactamas [7]. Del mismo modo, para Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, la resistencia a las tetraciclinas se ha incrementado de cero en 1948 a un nivel de 98% en 1998 [8].

Esto requiere una busqueda continua de nuevos antibióticos. Los peptidos antibacterianos inducibles representan un campo de estudio en el que convergen la bioquimica, la inmunologia y el diseno de farmacos contemporaneos. Los 25 antibióticos peptidicos, que varian en tamano de 13 a mas de un centenar de residuos de aminoacidos, se han aislado a partir de plantas, animales y microbios [9]. Un solo animal produce cerca de 6-10 antibióticos peptidicos, mostrando cada peptido a menudo un espectro de actividad completamente diferente [10]. Esta bien establecido que la inmensa mayoria de los peptidos antibacterianos, incluyendo las defensinas, cecropinas y magaininas bien estudiadas, funcionan a traves de un mecanismo quot;litico/ionofóricoquot;. Un punto comun de todos los peptidos quot;liticosquot; es 30 un efecto de permeabilización de las membranas citoplasmicas bacterianas [11, 12, 13]. Una estructura catiónica, anfipatica que permite la formación de canales iónicos hidrófilos (protones) en una bicapa lipidica es fundamental para esta actividad; la fuga de protones ocasiona la disipación del potencial de membrana, necesario para muchos procesos vitales esenciales, causando asi la muerte celular. Como la perturbación de las membranas por estos peptidos no es dependiente del reconocimiento de moleculas quirales, las sustituciones de aminoacidos que no 35 anulan la estructura anfipatica general o la carga neta basica son toleradas funcionalmente [14, 15]. Los peptidos que actuan directamente sobre la membrana bacteriana a menudo tienen tambien efectos t6xicos sobre las membranas de mamiferos a concentraciones mas altas, lo que limita su potencial como farmacos futuros. Cuando se insertan prolinas en las secuencias de los peptidos antimicrobianos a-helicoidales, la capacidad de los peptidos para permeabilizar la membrana citoplasmatica de E. coli disminuye sustancialmente como una función del numero de residuos de prolina incorporados. A este respecto, es interesante que algunos de los peptidos antibacterianos nativos mas activos, al menos frente a patógenos Gram-negativos seleccionados, pertenezcan a la familia de peptidos ricos en prolina [16].

Tales efectos secundarios pueden ser superados por otros peptidos antimicrobianos que se dirigen a proteinas bacterianas especificas u otros compuestos intra- o extracelulares sin reactividad cruzada con analogos de 45 mamifero. Esto parece ser cierto para peptidos antimicrobianos ricos en prolina, incluyendo la apidaecina, originalmente aislada de insectos. Con esta enorme variación en el tamano y las propiedades bioquimicas, no es sorprendente que las relaciones estructura-actividad y conformación-actividad sean el foco de los estudios de peptidos antibacterianos. Un reajuste completo del repertorio de peptidos antibacterianos naturales a sus potencias biológicas no sólo es importante en terminos de la bioquimica general, sino que tiene un interes permanente para la 50 industria farmaceutica. A pesar de los problemas con los ensayos in vitro de antibióticos basados en peptidos, unos pocos peptidos antibacterianos catiónicos nativos ya han alcanzado la fase de pruebas clinicas [17]. Mientras que algunos de ellos han dado muestras de eficacia en pruebas clinicas tempranas como agentes t6picos, otros muestran actividad como terapia sistemica. Por ejemplo, la proteina catiónica de rBPI 21 ha completado recientemente la fase III de pruebas clinicas para su uso parenteral en la meningococemia [17].

La apidaecina, que fue aislada originalmente de abejas, pertenece a la familia de peptidos antimicrobianos ricos en prolina y muestra similitudes de secuencia con pirrocoricina, drosocina y formaecina (Tabla 1) [18]. Las apidaecinas son peptidos de 18-20 residuos de longitud que contienen L-aminoacidos no modificados sólo con extremos C PRPPHPRI/L altamente conservados y un contenido de prolina relativamente alto (33%) . Pueden ser facilmente sintetizadas en fase sólida usando la estrategia Fmoc/tBu normal. El peptido inhibe la viabilidad de muchas bacterias 60 gram negativas en dosis nanomolares, mientras las gram positivas no se ven afectadas. La actividad letal es casi inmediata y se demostró que era independiente del mecanismo quot;liticoquot; convencional [19]. Ademas, los mutantes resistentes a la apidaecina tienen una sensibilidad sin merma a los peptidos quot;formadores de porosquot; y el enanti6mero D esta desprovisto de actividad antibacteriana. El modelo actual es que los efectos antag6nicos de la apidaecina sobre las bacterias implican el reconocimiento estereoselectivo de las dianas quirales [19]. Los peptidos antimicrobianos ricos en prolina que incluyen apidaecina como un miembro de esta familia no se limitan a eliminar las bacterias por permeabilización de sus membranas, sino que se unen estereoespecificamente a una proteina diana, que no se ha identificado para la apidaecina, y en ultima instancia conducen a la muerte celular. Por otra parte, en agudo contraste con los AMP con estructuras secundarias definidas como la melitina o la gramdicidina S, los peptidos ricos en prolina parecen no ser t6xicos in vitro para las celulas eucarióticas y no son hemoliticos. En suero de mamifero la apidaecina es completamente degradada en una hora debido a las divisiones en los extremos N y C, lo que podria ser el resultado de la escisión con amino-y carboxi-peptidasas, de la escisión con endoproteasas o de todo ello. Los metabolitos antes mencionados perdieron la actividad antimicrobiana con unos valores de CIM tipicamente por encima de 125 1g/ml.

Tabla 1: Comparación de las secuencias de apidaecina 1a o 1b (Apis mellifera) [18], drosocina (Drosophila melanogaster) [20], formaecina 1 (Myrmecia gulosa) [21], y pirrocoricina (Pyrrhocoris apterus) [22].

SEC ID NO Peptido Secuencia

1 Apidaecina 1a GNNRPVYIPQPRPPHPRI

2 Apidaecina 1b GNNRPVYIPQPRPPHPRL

161 Drosocina GKPRPYSPRPTSHPRPIRV

162 Formaecina 1 GRPNPVNNKPTPYPHL

163 Pirrocoricina VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN

Todavia existe una necesidad de nuevos compuestos anti-bacterianos y anti-fungicos, nuevas composiciones farmaceuticas anti-bacterianas y anti-fungicas, metodos de uso de los mismos, y compuestos novedosos que se puedan emplear en el analisis de escrutinio de farmacos para detectar nuevos antibióticos farmaceuticos.

Un objetivo de la invención es proporcionar nuevos peptidos antibióticos, preferiblemente con estabilidad elevada. Otro objetivo de la invención es proporcionar un metodo para el analisis de escrutinio de farmacos.

Este primer objetivo se resuelve mediante los peptidos de acuerdo con la invención, con al menos 16 residuos y la... [Seguir leyendo]

1. Un peptido con al menos 16 residuos y la fórmula general

Sub1-X1NX2X3PVYIPX4X5RPPHP-Sub2

en donde X1 es un residuo cargado positivamente;

X2 es un residuo con una cadena lateral polar o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas;

X3 es un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas;

X4 es un residuo neutro con una cadena lateral polar, preferiblemente no glutamina, o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas;

X5 es prolina o un derivado de prolina;

siendo Sub1 una modificación del grupo amino N-terminal, en el que la modificación es guanidación;

siendo Sub2 el grupo carboxilo C-terminal libre del aminoacido C-terminal o una modificación del grupo carboxilo Cterminal.

2. El peptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos un residuo adicional X6 y/o X7 en Sub2, mientras que X6 se selecciona entre prolina o un derivado de prolina o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas y X7 se selecciona entre de prolina o derivados prolina, un radical polar o un radical hidrófobo.

3. El peptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el residuo X1 se selecciona del grupo que consiste en arginina, lisina, o-hidroxilisina, homoarginina, D-arginina, metilarginina, alfa-N-metilarginina, nitroarginina, N (G) nitroarginina, nitrosoarginina, N (G) -nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropiónico, acido 2, 4-diaminobutirico, homoarginina, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2, 3-diaminopropiónico, acido 2, 2'-diaminopimelico, ornitina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, acido 2, 6-diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metilhistidina, y 3-amino-tirosina.

4. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el residuo X2 se selecciona del grupo que consiste en asparragina, glutamina, serina, treonina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina, citrulina, N-metilserina, N-metilglicina, dihidroxifenilalanina, N-etilasparragina, N-etilglicina, homoserina, penicilamina, tetrahidropiranilglicina, alo-treonina, 3, 5-dinitrotirosina, arginina, lisina, ohidroxilisina, homoarginina, acido 2, 4-diaminobutirico, homoarginina, -homoarginina, D-arginina, metilarginina, alfaN-metilarginina, nitroarginina, N- (G) -nitroarginina, nitrosoarginina, N- (G) -nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropiónico, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2, 3-diaminopropiónico, acido 2, 2'-diaminopimelico, ornitina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, acido 2, 6-diaminohexanoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, acido p-aminobenzoico, y 3-aminotirosina.

5. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, mientras que el residuo X3 se selecciona del grupo que consiste en arginina, lisina, o-hidroxilisina, homoarginina, acido 2, 4-diaminobutirico, -homoarginina, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2, 3-diaminopropiónico, acido 2, 2'-diaminopimelico, ornitina, metilarginina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, nitroarginina, nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropiónico, acido 2, 6-diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, y 3-amino-tirosina.

6. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el residuo X4 se selecciona del grupo que consiste en asparragina, N-metilserina, N-metilglicina, dihidroxifenilalanina, N-etilasparragina, N-etilglicina, homoserina, penicilamina, tetrahidropiranilglicina, alo-treonina, 3, 5-dinitrotirosina, y citrulina, asi como arginina, lisina, o-hidroxilisina, homoarginina, acido 2, 4-diaminobutirico, -homoarginina, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2, 3-diaminopropiónico, acido 2, 2'-diaminopimelico, ornitina, metilarginina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, nitroarginina, nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropiónico, acido 2, 6diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, y 3-amino-tirosina.

7. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el residuo X5 es prolina o un derivado de prolina seleccionado del grupo que consiste de cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina, -ciclohexilalanina, 3, 4-cis-metanoprolina, 3, 4-deshidroprolina, homoprolina y pseudoprolina.

8. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde el residuo X6 se selecciona del grupo que consiste en prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3-hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina,

- ciclohexilalanina, 3, 4-cis-metanoprolina, 3, 4-deshidroprolina, homoprolina, pseudoprolinas, arginina, preferiblemente D-arginina, o-hidroxilisina, homoarginina, acido 2, 4-diaminobutirico, -homoarginina, £-N-metil lisina, alo-hidroxilisina, acido 2, 3-diaminopropiónico, acido 2, 2'-diaminopimelico, lisina, ornitina, metilarginina, dimetilarginina simetrica, dimetilarginina asimetrica, nitroarginina, nitrosoarginina, arginal, acido guanidinopropiónico, acido 2, 6-diaminohexinoico, histidina, 1-metil-histidina, 3-metil-histidina, y 3-amino-tirosina.

9. El peptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos un residuo adicional X6 y/o X7 en Sub2, mientras que X6 se selecciona entre prolina o un derivado de prolina o un radical que tiene una carga neta positiva o una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas y X7 se selecciona del grupo que consiste en prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, cis-3-hidroxiprolina, trans-3-hidroxiprolina, -ciclohexilalanina, 3, 4cis-metanoprolina, 3, 4-deshidroprolina, homoprolina, pseudoprolinas, serina, treonina, citrulina, N-metilserina, Nmetilglicina, dihidroxifenilalanina, N-etilasparragina, N-etilglicina, homoserina, penicilamina, tetrahidropiranilglicina, alo-treonina, 3, 5-dinitrotirosina, o-hidroxilisina, fenilalanina, leucina, isoleucina, valina, metionina, alanina, acido 1aminociclohexilcarb6nico, N-metilleucina, N-metilisoleucina, terc-butilglicina, -alanina, norleucina, norvalina, Nmetilvalina, acido 6-aminocaproico, acido 2-aminoheptanoico, acido 2-aminoisobutirico, acido 3-aminoisobutirico, acido aminovalerico, acido 2-aminopimelico, acido pipecolónico, tript6fano, yodo-tirosina, 3, 5-diyodo-tirosina, 3, 5dibromotirosina, -ciclohexilalanina, acido p-aminobenzoico, acido £-aminocaproico, 3, 4-cis-metanoprolina, fenilglicina, 3, 4-deshidroprolina, acido 4-amino-5-ciclohexil-3-hidroxipentanoico, O-fosfotirosina, O-sulfotirosina, acido aminoetillpirrolocarboxilico, acido 4-aminopiperidino-4-carboxilico, acido a-aminoadipico, homoprolina, homofenilalanina, p-fluoro-fenilalanina, 3, 4-diclorofenilalanina, p-bromo-fenilalanina, p-yodo-fenilalanina, p-nitrofenilalanina, una secuencia peptidica corta, y un conector ramificado que contiene varias unidades peptidicas.

10. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de acuerdo con los SEQ ID NO: 88, 120, 125, 128, 134, 137, 146, 147, 151, 155, 156, 157, y 158.

11. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde al menos uno de los enlaces peptidicos de la cadena principal del peptido se sustituye por un enlace no escindible.

12. El peptido de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el enlace entre X6-X7 es un enlace no escindible.

13. El peptido de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde el enlace no escindible se selecciona del grupo que consiste en un enlace amida reducido, un enlace amida alquilado, y un enlace tioamida.

14. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que esta fusionado a una proteina o acoplado a un polimero.

15. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicho peptido esta unido a un portador.

16. Un multimero, en donde al menos dos peptidos se acoplan entre si, mientras que al menos uno de los peptidos es un peptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Una composición farmaceutica que comprende al menos uno de los peptidos o un multimero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Un peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o un multimero de acuerdo con la reivindicación 16 o una composición farmaceutica de acuerdo con la reivindicación 17, para su uso en el tratamiento de una infección microbiana, bacteriana o fungica en un mamifero.

19. El uso de un peptido o un multimero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, como agente de limpieza, como agente de conservación o en un material de envasado.

20. El uso de un peptido o un multimero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16 en un metodo de escrutinio.

21. Un metodo para identificar un compuesto, que tiene un efecto antimicrobiano, bactericida o antifungico, que comprende:

(i) realizar un analisis competitivo con:

(a) un microorganismo susceptible a un peptido o multimero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16;

(b) un peptido o multimero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16; y

(c) al menos un compuesto que se va a someter a ensayo;

mediante la exposición de (a) a (b) y (c) ; y

(ii) seleccionar un compuesto de ensayo que desplaza competitivamente la unión del peptido o multimero al microorganismo.

22. El metodo de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el microorganismo es una especie que pertenece a uno de los generos seleccionados entre Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Errinia amylovora, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti y Haemophilus influenzae.