Péptido de direccionamiento plastidial.

Polipéptido de direccionamiento intraplastidial, caracterizado porque está constituido por:

- un dominio A constituido por un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de almenos el 65 %, con uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5;

y al menos un dominio seleccionado entre:

- un dominio B situado en el extremo N-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de lospolipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 49 a 59 de dichopolipéptido, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud deal menos el 65 %, con dicho fragmento;

- un dominio C situado en el extremo C-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de lospolipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 101 a 111, y comomáximo los aminoácidos 101 a 151 de dicho polipéptido, o alternativamente de un polipéptido que presenta unaidentidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento.

Péptido de direccionamiento plastidial

La presente invención se refiere a la producción de proteínas de interés en plantas, y en particular a su 5 direccionamiento hacia el compartimento del plastidio.

Los plastos son orgánulos intracelulares de las plantas clorofílicas (algas, musgos, y plantas superiores) . Existen diversos tipos principales de plástidos, según su contenido en pigmentos, y su naturaleza: los amiloplastos, ricos en almidón, los cloroplastos en los que los pigmentos principales son las clorofilas, y los cromoplastos cuyos pigmentos principales son los carotenoides. Estas tres clases de plástidos procedentes de precursores comunes, los proplastos, poseen una estructura básica común constituida por una doble membrana que encierra el estroma del plastidio. En los cloroplastos, existe un tercer sistema de membrana que forma unos sáculos en el interior del estroma denominados tilacoides.

Aparte de su papel primordial en la fotosíntesis, los cloroplastos también están implicados en reacciones de óxidoreducción, por ejemplo, la reducción de nitritos en amonio. Los plastos también desempeñan un papel esencial en la biosíntesis y/o almacenamiento de numerosas moléculas, entre las que se pueden citar el almidón, lípidos, carotenoides, la mayoría de aminoácidos, hormonas vegetales (ácido abscísico, precursores de giberelinas, del jasmonato, etc.) .

A pesar de que los plastos tienen su propio genoma que codifica una parte de sus proteínas, una gran parte de las enzimas que intervienen en las diferentes funciones plastidiales están codificadas por el genoma nuclear y son importadas al interior de los plastos.

Esta importación se lleva a cabo por un mecanismo específico, que se ha estudiado más específicamente en el caso de los cloroplastos (para una revisión, cf. CHEN y SCHNELL, Trends Cell Biol. 9, 222 – 227, 1999; KEEGSTRA y CLINE, The Plant Cell 11, 557 – 570, 1999; SCHLEIFF y SOLL, Planta 211, 449 – 456, 2000; JACKSON-CONSTAN y KEEGSTRA, Plant Physiol. 125, 1567 – 1676, 2001) . Este mecanismo implica la intervención de un sistema de importación en cada una de las dos membranas plastidiales: en la membrana externa, el complejo TOC (translocón en la membrana externa del cloroplasto) que comprende al menos tres proteínas: Toc 86, 75 y 34 (KESSLER et al, Science 266, 1035 – 1039, 1994; PERRY y KEEGSTRA, Plant Cell 6, 93 – 105, 1994) ; en la membrana interna, el complejo TIC (translocón en la membrana interna del cloroplasto) que comprende al menos cuatro proteínas: Tic 110, 55, 22 y 20 (KESSLER y BLOBEL, Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7684 – 7689, 1996; LÜBECK et al., EMBO J. 15, 4230 – 4238, 1996; CALIEBE et al., EMBO J. 16, 7342 – 7350, 1997; KOURANOV et al., J. Cell Biol., 143, 991 –

1002, 1998) , y una proteína chaperona en el estroma: ClpC (AKITA et al., J. Cell Biol. 136, 983 – 994, 1997; NIELSEN et al., EMBO J. 16, 935 – 946, 1997) .

Un elemento importante de este mecanismo es Toc75, que es la proteína más abundante en la membrana externa, y forma el poro central del canal de translocación situado en esta membrana (SCHNELL et al., Science 266, 1007 – 1012, 1994; TRANEL et al., EMBO J. 14, 2436 – 2446, 1995) . Toc75 interactúa específicamente con una secuencia particular, denominada "péptido de direccionamiento" o "péptido de tránsito", que se encuentra en el extremo Nterminal de las proteínas importadas al interior de los plastos (MA et al, J. Cell Biol. 134, 315 – 327, 1996) .

Muchos péptidos de direccionamiento han sido identificados en los precursores de proteínas dirigidas hacia el

espacio intermembrana, la membrana interna, el estroma, y en el caso de los cloroplastos, hacia la membrana del tilacoides.

Entre las proteínas que se sabe que poseen un péptido de direccionamiento intraplastidial escindible se pueden citar en particular proteínas dirigidas al espacio intermembrana, (Tic22: KOURANOV et al., 1998, mencionado anteriormente; KOURANOV et al., J. Biol. CHEM. 274, 25181 – 25194, 1999) , proteínas dirigidas a la membrana interna (TPT (translocador de triosa-Pi/Pi) : BRINK et al., J. Biol. Chem. 270, 20808 – 20815, 1995) , proteínas dirigidas al estroma (subunidad pequeña de la ribulosa-1, 5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) : DE CASTRO SILVA FILHO et al., Plant Mol. Biol. 30, 769 – 780, 1996, anhidrasa carbónica) , proteínas dirigidas a la membrana del tilacoides (LHCP (complejo de captación de luz) : LAMPPA et al, J. Biol. Chem. 263, 14996 – 14999, 1988; Cfo-II:

subunidad ATPasa) y al lumen del tilacoides (OEE1 (Oxygen Evolving Element 1) : KO y CASHMORE, EMBO J. 8, 3187 – 3194, 1989) .

Estos péptidos de direccionamiento en general contienen entre 40 y 100 aminoácidos, y en su mayor parte comprenden características comunes: están prácticamente desprovistos de aminoácidos cargados negativamente, como el ácido aspártico, el ácido glutámico, la asparagina o la glutamina; su región N-terminal está desprovista de aminoácidos cargados, y de aminoácidos como la glicina o la prolina; su región central contiene una proporción muy

elevada de aminoácidos básicos o hidroxilados, tales como la serina y la treonina; su región C-terminal es rica en arginina y tiene la capacidad de formar una estructura secundaria anfipática, en lámina beta.

En el caso de proteínas dirigidas al lumen del tilacoides, el péptido de direccionamiento consta de dos partes y contiene información adicional para atravesar la membrana del tilacoides (DE BOER y WEISBEEK, Biochim. Biophys. Acta. 1071, 221 – 253, 1991) . En algunos casos, este péptido de direccionamiento que consta de dos partes también se puede encontrar en las proteínas dirigidas a la membrana del tilacoides (KARNAUCHOV y col., J. Biol. Chem. 269, 32.871 – 32.878, 1994) .

En todos los casos, el péptido de direccionamiento se escinde después de su importación. Esta escisión se lleva cabo por proteasas específicas; se han descrito una proteasa localizada en el estroma (VANDERVERE et al, Proc Natl. Acad. Sci. 92, 7177 – 7181, 1995) , y una proteasa localizada en el lumen del tilacoides (CHAAL et al, J. Biol. Chem. 273, 689 – 692, 1998) .

Las proteínas dirigidas a la membrana externa generalmente no contienen el péptido señal escindible; la información de direccionamiento está contenida en la proteína madura (CLINE y HENRY, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 12, 1 – 26, 1996) ; después de su síntesis en el citosol, estas proteínas se incorporan directamente a la membrana (VAN'T HOF et al, FEBS Lett. 291, 350 – 354, 1991 y J. Biol. Chem. 268, 4037 – 4042, 1993; PINADUWAGE y BRUCE, J. Biol. Chem. 271, 32907 – 32915, 1996) por medio de interacciones, cuya naturaleza aún no está clara, con la bicapa lipídica. La única excepción conocida hasta la fecha se refiere a la proteína Toc75 u (OEP75) en la que el direccionamiento hacia la membrana externa requiere de la presencia de un péptido de direccionamiento N-terminal escindible que consta de dos partes (TRANEL et al, 1995, anteriormente mencionada; TRANEL y KEEGSTRA, Plant Cell 8, 2093 – 2104, 1996) .

Es sabido que es necesaria la utilización de péptidos de direccionamiento hacia los plastos para introducir en ellos proteínas de interés que permitan actuar sobre diversas funciones plastidiales, en particular, con el fin de mejorar las características de las plantas de interés agronómico, por ejemplo, la biosíntesis de lípidos, de almidón, de vitaminas, de hormonas o de proteínas por parte de dichas plantas, o su resistencia a enfermedades, insectos, o herbicidas. Por ejemplo, la Solicitud EP 189707, así como la Solicitud PCT WO 88/02402 proponen la utilización de péptidos de direccionamiento escindibles procedentes de precursores de proteínas cloroplásticas, y en particular del péptido de direccionamiento de la subunidad pequeña de la ribulosa-1, 5-bisfosfato carboxilasa, para la importación de una proteína de interés hacia los cloroplastos; la Solicitud PCT WO 00/12732 propone la utilización de péptidos de direccionamiento de diferentes proteínas plastidiales para la importación de proteínas de interés hacia los plastos.

Las funciones plastidiales se pueden modificar de esta forma, y las características conferidas por estas modificaciones son muy diversas.

Con fines ilustrativos no limitantes, se pueden citar:

- el aumento de la resistencia a herbicidas, mediante la expresión del precursor de la acetolactato sintetasa (ALS) , (LEE et al EMBO J., 7, 1241 – 1248, 1988) , de la acetolactato sintetasa mutada (PRESTON y POWLES, Heredity 88, 8 – 13,... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido de direccionamiento intraplastidial, caracterizado porque está constituido por:

- un dominio A constituido por un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5;

y al menos un dominio seleccionado entre:

- un dominio B situado en el extremo N-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 49 a 59 de dicho polipéptido, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento;

- un dominio C situado en el extremo C-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 101 a 111, y como máximo los aminoácidos 101 a 151 de dicho polipéptido, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento.

2. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio B está constituido de un fragmento que comprende al menos los aminoácidos 39 a 59 de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento.

3. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el dominio C está constituido por un fragmento que comprende al menos los aminoácidos 101 a 121 de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento.

4. Polipéptido quimérico, que comprende un polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 fusionado con una proteína heteróloga.

5. Polipéptido quimérico de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido de direccionamiento intraplastidial está situado en el extremo N-terminal de la proteína heteróloga.

6. Uso de un polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con la reivindicación 1 para la importación de una proteína de interés hacia plástidos.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho polipéptido de direccionamiento intraplastidial se utiliza para importar dicha proteína de interés hacia los cloroplastos.

8. Procedimiento para la importación de una proteína de interés hacia plástidos, caracterizado porque comprende la expresión, en una célula vegetal que contiene dichos plástidos, de un polipéptido quimérico que resulta de la fusión de un polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con la reivindicación 1 con dicha proteína de interés.

9. Polinucleótido codificante para un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Casete de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 situado bajo el control de secuencias para regular la transcripción.

11. Vector recombinante que resulta de la inserción de un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 o de un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 10 en un vector hospedador.

12. Planta transgénica transformada mediante, y que comprende, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 o un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 10.