Péptido antibiótico derivado de plantas rico en glicina.

Un péptido antibiótico rico en glicina con actividad antimicrobiana que comprende la secuencia de aminoácidosidéntica expuesta a continuación:

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Péptido antibiótico derivado de plantas rico en glicina

Campo de la invención La presente invención se refiere a un nuevo péptido extraído de las semillas de guayaba (Psidium guajava) , que posee actividad bactericida, especialmente contra bacterias gram negativas que se sabe que provocan infecciones urinarias, hospitalarias y del tracto intestinal (Proteus sp. y Klebsiella sp.) . El péptido posee la secuencia de aminoácidos RESPSSRMEC YEQAERYGYG GYGGGRYGGG YGSGRGQPVG QGVERSHDDN RNQPR, y pertenece a la clase de proteínas ricas en glicina con un peso molecular aproximado de 5 kDa.

Antecedentes de la invención En las últimas dos décadas ha habido un aumento significativo de la resistencia bacteriana a antibióticos sintéticos disponibles en el mercado. Las bacterias gram negativas de la familia Enterobacteriaceae, tales como Klebsiella sp. y Proteus sp., que eran anteriormente susceptibles a medicinas son en la actualidad la principal causa de infecciones hospitalarias en varios países en desarrollo (Mendes, 2000) . En consecuencia, se ha presentado un aumento de la tasa de mortalidad de pacientes inmunodeprimidos infectados con estas bacterias. En respuesta a este problema, se han aislado varios compuestos de origen proteico que tienen actividad antimicrobiana de diferentes especies de plantas, mamíferos y microorganismos (Campos et al., 2006; Bevins, 2006) .

Varias proteínas vegetales han demostrado actividad contra bacterias y hongos (Selitrenikkoff, 2001) . Normalmente tienen un papel preponderante en la defensa de la planta, protegiéndola de patógenos ambientales. Estas proteínas se han clasificado dentro de diversos grupos y familias de acuerdo con sus similitudes estructurales y funcionales. Estas incluyen ciclótidos, defensinas, !-tioninas, Proteínas Transportadoras de Lípidos (LTP) , lectinas, inhibidores de enzimas digestivas y diversas otras (Selitrenikkoff, 2001, Pelegrini y Franco, 2005; Franco et al., 2002; Pelegrini et al., 2006) .

Las proteínas ricas en glicina (o GRP) consisten en un nuevo grupo de moléculas de defensa vegetal que se ha descrito que tienen actividad antimicrobiana. Se caracterizaron inicialmente como proteínas de almacenamiento, usándose como fuentes esenciales de aminoácidos (Mousavi, 2005) . Estudios anteriores han indicado la actividad de proteínas ricas en glicina en la adaptación al frío y en tolerancia creciente a temperaturas bajas, que actúan como factores de unión a ARN (Shinozuka, 2006) . Además, se ha demostrado que la expresión de su ARNm

correspondiente aumenta en plantas expuestas a temperaturas bajas (Shinozuka, 2006) . Además, se ha observado que las proteínas ricas en glicina pueden alterar la germinación y el crecimiento de plantas en condiciones de tensión, tales como altas concentraciones salinas o deshidratación (Kwak, 2005) . Estudios anteriores indicaron que ocho proteínas ricas en glicina aisladas de semillas de Triticum kiharae no demostraron actividad antimicrobiana contra bacterias pero mostraron, sin embargo, actividad contra hongos filamentosos, tales como Helminthosporium

sativum y Fusarium culmorum (Egorov, 2005) . Las GRP pueden caracterizarse por su alto porcentaje de restos de glicina y su secuencia primaria pero, sin embargo, esta varía con cada planta y organismo (Mousavi, 2005) . Las proteínas ricas en glicinia pueden clasificarse dentro de tres grupos diferentes de acuerdo con su contenido de glicina. El primer grupo contiene proteínas que presentan más del 70% de restos de glicina en la secuencia de aminoácidos, tales como GRP de tomate y plantas de sal (Ringli, 2001) . También hay un tercer grupo que incluye 45 proteínas de alto contenido en glicina pero que no tienen dominios específicos (Ringli, 2001) . Las proteínas de este grupo son normalmente hidrófobas en lugar de hidrófilas provocándose posiblemente este rasgo por la presencia de tirosina y fenilalanina (Ringli, 2001) . La estructura secundaria de las GRP no se ha estudiado completamente pero las investigaciones preliminares indican que puede ser predominantemente rica en láminas ∀ (Matsui, 1995) .

Investigaciones previas indican que se encuentran genes de proteínas ricas en glicina principalmente en tejidos vasculares, más específicamente en el xilema (Ryser, 1992; Keller, 1988; Keller, 1989) , a pesar de que también se han encontrado en hipocótilos y pistilos (Ye, 1991) . La expresión de genes de GRP parece estar ligada a la inducción por tensión e influida por cambios ambientales, tales como heridas, tratamiento hormonal, temperaturas bajas y deshidratación (Keller, 1988; de Oliveira, 1990; Bergeron, 1994; Keister, 1995; Laberge, 1993; Condit; 1987) .

Este trabajo tiene el objetivo de purificar y caracterizar una proteína antimicrobiana de semillas de guayaba (PgAMP1) similar a proteínas ricas en glicina. Se demostró que esta proteína era capaz de inhibir el crecimiento de dos bacterias gram negativas, ambas reconocidas como causantes de infecciones hospitalarias, así como infecciones urinarias y gastrointestinales. Este es el primer informe de una proteína del grupo de proteínas ricas en 60 glicina que demuestra actividad contra bacterias patógenas humanas.

La proteína PgAMP1 identificada de la presente investigación y objeto de la presente invención demostró ser capaz de inhibir el crecimiento de dos bacterias gram negativas (Proteus sp. y Klebsiella sp.) y la secuencia de 55 aminoácidos permitió su clasificación como un miembro de las proteínas ricas en glicina.

La búsqueda de referencias anteriores desveló documentos que describían la actividad antibacteriana de aceites esenciales o extractos (acuosos, hidroalcohólicos, etanólicos, metabólicos y/o clorofórmicos) de Psidium guajava contra diferentes especies bacterianas (véase Tabla 1, posterior) . Se usaron diferentes partes de la planta para obtener los extractos, principalmente las hojas y la corteza del tallo. No hay informes del uso de semillas de P.

guajava para obtener compuestos que tengan actividad antibacteriana.

Tabla 1: Microorganismos e informes respectivos de actividad antibacteriana en extractos o aceites esenciales de Psidium guajava.

Especie Referencias

Actinomyces sp. Razak et al. (2006) .

Bacillus anthracis Akinpelu y Onakoya (2006) .

Bacillus cereus Akinpelu y Onakoya (2006) ; Arima y Danno (2002) .

Bacillus subtilis Akinpelu y Onakoya (2006) ; Karawya et al. (2001) ; Martínez et al. (1997) ; Rabe y van Staden (1997) ; Sanches et al. (2005) .

Clostridium sporogenes Akinpelu y Onakoya (2006) .

Cor y nbacterium pyogenes Akinpelu y Onakoya (2006) .

Escherichia coli Abdelrahim et al. (2002) ; Akinpelu y Onakoya (2006) ; Carvalho (2002) ; Chah et al. (2006) ; Martínez et al. (1997) ; Rivera de León et al. (2001) ; Vieira et al. (2001) ; Voravuthikunchai et al. (2004) .

Klebsiella pneumoniae Abdelrahim et al. (2002) ; Akinpelu y Onakoya (2006) ; Rivera de León et al. (2001) .

Mycobacteriumphlei Karawya et al. (2001) .

Propionibacterium acnes Qadan et al. (2005) .

Proteus mirabilis Gonçalves et al. (2005) ; Karawya et al. (2001) .

Proteus morganii Karawya et al. (2001) .

Proteus spp. Carvalho (2002) ; Chah et al. (2006) .

Proteus vulgaris Abdelrahim et al. (2002) ; Karawya et al. (2001) .

Pseudomonas aeruginosa Abdelrahim et al. (2002) ; Akinpelu y Onakoya (2006) ; Carvalho (2002) ; Chah et al. (2006) ; Gnan y Demello (1999) ; Martínez et al. (1997) ; Rivera de León et al. (2001) .

Pseudomonas fluorescens Akinpelu y Onakoya (2006) .

Salmonella enteritidis Arima y Danno (2002) .

Salmonella paratyphi Lutterodt et al. (1999) .

Salmonella spp. Carvalho (2002) .

Salmonella typhi Lutterodt et al. (1999) .

Salmonella typhimurium Gnan y Demello (1999) ; Lutterodt et al. (1999)

Shigelladysenteriae Akinpelu y Onakoya (2006) ; AIi et al. (1997) ; AIi et al. (1996) ; Lutterodt et al. (1999)

Shigella flexneri Lutterodt et al. (1999) .

Shigella sonnei Lutterodt et al. (1999) .

Shigella spp Carvalho (2002) ; Chah et al. (2006) .

Staphylococcus aureus Abdelrahim et al. (2002) ; Akinpelu y Onakoya (2006) ; Betoni et al. (2006) ; Chah et al. (2006) ; Gnan y Demello (1999) ; Gonçalves et al. (2005) ; Jaiarj et al. (1999) ; Lutterodt et al. (1999) ; Martínez et al. (1997) ; Nascimento et al. (2000) ; Qadan et al. (2005) ; Rabe y van Staden (1997) ; Rivera de León et al. (2001) ; Sanches et al. (2005) ; Vieira et al. (2001) .

Streptococcusepidermidis Gnan y Demello (1999) ; Qadan et al. (2005) ; Rabe y van Staden (1997) .

Streptococcusfaecalis Akinpelu y Onakoya (2006) .

Streptococcusmitis Razak et al. (2006) .

Streptococcus pyogenes Gnan y Demello (1999) ; Gonçalves et al. (2005)... [Seguir leyendo]

1. Un péptido antibiótico rico en glicina con actividad antimicrobiana que comprende la secuencia de aminoácidos idéntica expuesta a continuación:

RESPSSRMECYEQAERYGYGGYGGGRYGGGYGSGRGQPVGQGVERSHDDNRNQPR.

2. Péptido antibiótico de la reivindicación 1, en el que la cadena peptídica de longitud completa o partes de la misma comprende los aminoácidos #-D-y/o #-L. 10

3. Composición para inhibir el desarrollo de una célula Proteus sp. o una célula Klebsiella sp., que comprende:

(a) al menos un péptido antibiótico de acuerdo con la reivindicación 1,

(b) opcionalmente uno o más péptidos antibióticos que tienen actividad antimicrobiana; y 15 (c) un excipiente farmacéutico adecuado.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que dicha composición es adecuada para usos humanos, veterinarios

o farmacéuticos.

5. Composición para detener fitopatógenos y para proteger plantas contra patógenos, que comprende:

(a) al menos un péptido antibiótico de acuerdo con la reivindicación 1, y

(b) un vehículo agrícolamente aceptable.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción