Pegilación de factores de coagulación sanguínea recombinantes en presencia de anticuerpos enlazados.

Método para conjugar un polímero soluble en agua (PSA) en un factor FVIII (FVIII) que consiste en:

(a) incubar FVIII con anticuerpo específico de FVIII bajo condiciones que permiten la unión de dicho anticuerpo a dicho FVIII formando un complejo anticuerpo:FVIII;

(b) incubar el complejo anticuerpo:FVIII con dicho PSA bajo condiciones que permiten la conjugación del PSA con el complejo anticuerpo:FVIII; y

(c) liberar el FVIII conjugado con PSA del anticuerpo, y

seleccionándose el PSA de entre el grupo consistente en polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, ácido polisiálico (APS), carbohidrato, polisacáridos, pululano, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, almidón, dextrano, carboximetildextrano, óxido de polialquileno (OPA), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG) polioxazolina, poliacriloilmorfolina, alcohol polivinílico (APV), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfaceno, polioxazolina, polietileno-co-anhídrido maleico, poliestireno-co-anhídrido maleico, poli(1-hidroximetiletilen-hidroximetilformal) (PHF) y/o fosfato de 2-metacriloiloxi-2'-etiltrimetilamonio (MPC).

Pegilación de factores de coagulación sanguínea recombinantes en presencia de anticuerpos enlazados.

La presente invención se refiere a un método para conjugar el factor de coagulación sanguínea VIII (FVIII) con un polímero soluble en agua, incluyendo un óxido de (poli) alquileno tal como polietilenglicol (PEG) en presencia de anticuerpos enlazados. También se describen métodos para prolongar la vida media in vivo del FVIII en la sangre de un mamífero que padece un trastorno hemorrágico asociado a defectos funcionales o deficiencias de FVIII.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El factor de coagulación VIII (FVIII) circula en el plasma en una concentración muy baja y está unido de forma no covalente al factor von Willebrand (FVW) . Durante la hemostasia, el FVIII se separa del FVW y actúa como cofactor para la activación del factor X (FX) mediada por el factor IX activado (FIXa) mediante el aumento de la velocidad de activación en presencia de calcio y fosfolípidos o membranas celulares.

El FVIII se sintetiza como un precursor de cadena única de aproximadamente 270-330 kD con la estructura de dominio A1- A2- B- A3- C1- C2. Cuando se purifica a partir de plasma (por ejemplo, "derivado de plasma" o "plasmático") , el FVIII está compuesto por una cadena pesada (A1- A2- B) y una cadena ligera (A3- C1- C2) . La masa molecular de la cadena ligera es de 80 kD, mientras que, debido a la proteólisis dentro del dominio B, la cadena pesada oscila entre 90 y 220 kD.

El FVIII también se sintetiza como una proteína recombinante para uso terapéutico en caso de alteraciones hemorrágicas. Ya se han concebido diversos ensayos in vitro para determinar la eficacia potencial del FVIII recombinante (FVIIIr) como medicina terapéutica. Estos ensayos emulan los efectos in vivo del FVIII endógeno. El tratamiento de FVIII con trombina in vitro conduce a un rápido aumento y disminución subsiguiente de su actividad procoagulante, según medidas en ensayos in vitro. Esta activación e inactivación coincide con una proteólisis limitada específica tanto en las cadenas pesadas como en las ligeras que altera la disponibilidad de diferentes epítopos de unión en FVIII, por ejemplo permitiendo que el FVIII se disocie del FVW y se una a una superficie fosfolipídica o alterando la capacidad de unión a determinados anticuerpos monoclonales.

La falta o disfunción del FVIII está asociada al trastorno hemorrágico más frecuente, la hemofilia A. El tratamiento preferente para la hemofilia A es la terapia de sustitución con derivado plasmático o con concentrados de FVIIIr. En general, los pacientes de hemofilia A grave con niveles de FVIII por debajo del 1% se someten a una terapia profiláctica con el fin de mantener el FVIII por encima del 1% entre dosis. Teniendo en cuenta las vidas medias de los diversos productos de FVIII en la circulación, esto se consigue normalmente administrando FVIII dos o tres veces por semana.

En el mercado existen muchos concentrados para el tratamiento de la hemofilia A. Uno de estos concentrados es el producto recombinante Advate®, que se produce en células CHO y es fabricado por Baxter Healthcare Corporation. No se añade ninguna proteína o albúmina de plasma humano o animal en el proceso de cultivo celular, la purificación o la formulación final de este producto.

El objetivo de muchos fabricantes de concentrados de FVIII y fármacos de polipéptidos terapéuticos es desarrollar un producto de nueva generación con propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas mejoradas, manteniendo todas las demás características del producto.

Con frecuencia, los fármacos de polipéptidos terapéuticos son degradados rápidamente por enzimas proteolíticas y neutralizados por anticuerpos. Esto reduce su vida media y el tiempo de circulación, limitando así su eficacia terapéutica. Sin embargo, se ha demostrado que la adición de un polímero soluble o de un carbohidrato a un polipéptido previene la degradación y aumenta la vida media de los polipéptidos. Por ejemplo, la PEGilación de fármacos de polipéptido los protege y mejora sus perfiles farmacodinámicos y farmacocinéticos (Harris J M y Chess R B, Nat Rev Drug Discov 2003;2:214-21) . El proceso de PEGilación une unidades de repetición de polietilenglicol (PEG) a un fármaco de polipéptido. La PEGilación de moléculas puede conducir a un aumento de la resistencia de los fármacos a la degradación enzimática, a un aumento de la vida media in vivo, a una reducción de la frecuencia de dosificación, a una menor inmunogenicidad, a un aumento de la estabilidad física y térmica, a un aumento de la solubilidad, a un aumento de la estabilidad en líquido y a una menor agregación.

Por consiguiente, una propuesta para mejorar las propiedades de un producto de FVIII consiste en la adición de un polímero soluble, por ejemplo por PEGilación. El estado actual de la técnica está documentado en diferentes patentes y solicitudes de patente.

La Patente US nº 6.037.452 describe un conjugado de óxido de (poli) alquileno-FVIII o FIX en el que la proteína está unida de forma covalente con un óxido de (poli) alquileno a través de los grupos carbonilo del FVIII.

El documento EP1258497B1 describe un método para preparar conjugados de FVIII y un polímero biocompatible. Esta patente se complementa mediante una publicación de Röstin y col. (Bioconj Chem 2000; 11:387-96) . Los conjugados comprenden un FVIII recombinante con deleción del dominio B modificado con monometoxipolietilenglicol. El conjugado tenía una función de FVIII reducida y la actividad coagulante disminuía rápidamente con el grado de modificación.

El documento WO04075923A3 describe un conjugado molecular de polímero-FVIII que comprende múltiples conjugados, teniendo cada conjugado de uno a tres polímeros solubles en agua unidos de forma covalente a una molécula de FVIII. La molécula de FVIII presenta una deleción del dominio B.

La Patente US nº 4.970.300 describe un FVIII modificado donde un conjugado no fusible que comprende una proteína con actividad de FVIII está unido de forma covalente a un ligando no antigénico.

La Patente US nº 6.048.720 describe conjugados de un polipéptido y un polímero biocompatible.

El documento WO94/15625 describe un FVIII unido a polietilenglicol con un peso molecular preferente no superior a 5.000 Dalton.

No obstante, sigue existiendo la necesidad de un FVIII mejorado que tenga un polímero soluble unido para prolongar la vida media del FVIII in vivo, que mantenga la actividad funcional mientras proporciona una vida media prolongada in vivo en comparación con FVIII no modificado y otros agentes terapéuticos de FVIII modificado conocidos en la técnica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para conjugar un polímero soluble en agua (PSA) con factor FVIII (FVIII) según la reivindicación 1.

El método para conjugar un polímero soluble en agua (PSA) con una molécula de factor FVIII (FVIII) comprende (a) incubar el FVIII con un anticuerpo específico de FVIII bajo condiciones que permitan la unión de dicho anticuerpo a dicho FVIII formando un complejo anticuerpo:FVIII; (b) incubar el complejo anticuerpo:FVIII con dicho PSA bajo condiciones que permitan la conjugación del PSA con el complejo anticuerpo:FVIII; y (c) liberar el FVIII conjugado con PSA del anticuerpo.

Aquí también se proporciona un constructo proteináceo que comprende (a) una molécula de factor FVIII (FVIII) ; y (b) al menos una molécula de polímero soluble en agua (PSA) unida a la molécula de factor VIII; estando conjugados dicho o dichos PSA con dicha molécula de FVIII en presencia de un anticuerpo que se une específicamente a FVIII. En una realización relacionada, la molécula de factor VIII es un factor VIII recombinante. En otra realización, la molécula de factor VIII es un factor VIII de longitud completa.

En otra realización de la invención, la molécula de PSA es una molécula de PEG. En una realización relacionada, la molécula de PSA tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 150.000 Da, o de entre aproximadamente 10.000 y aproximadamente 50.000 Da. En otra realización, la molécula de PSA tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. En otra realización más de la invención, la molécula de PSA tiene una estructura lineal o ramificada.

En otra realización de la invención, el anticuerpo mencionado está inmovilizado en una resina.

La presente invención contempla métodos para conjugar PSA de la invención. El método para conjugar un polímero soluble en agua (PSA) con factor VIII (FVIII) consiste en (a) incubar el FVIII con anticuerpo... [Seguir leyendo]

1. Método para conjugar un polímero soluble en agua (PSA) en un factor FVIII (FVIII) que consiste en:

(a) incubar FVIII con anticuerpo específico de FVIII bajo condiciones que permiten la unión de dicho 5 anticuerpo a dicho FVIII formando un complejo anticuerpo:FVIII;

(b) incubar el complejo anticuerpo:FVIII con dicho PSA bajo condiciones que permiten la conjugación del PSA con el complejo anticuerpo:FVIII; y

(c) liberar el FVIII conjugado con PSA del anticuerpo, y

seleccionándose el PSA de entre el grupo consistente en polietilenglicol (PEG) , PEG ramificado, ácido polisiálico (APS) , carbohidrato, polisacáridos, pululano, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, almidón, dextrano, carboximetildextrano, óxido de polialquileno (OPA) , polialquilenglicol (PAG) , polipropilenglicol (PPG) polioxazolina, poliacriloilmorfolina, alcohol polivinílico (APV) , policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfaceno, polioxazolina, polietileno-co-anhídrido maleico, poliestireno-co-anhídrido maleico, poli (1-hidroximetiletilen-hidroximetilformal) (PHF) y/o fosfato de 2

metacriloiloxi-2'-etiltrimetilamonio (MPC) .

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el FVIII es FVIII de longitud completa.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el PSA tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 150.000 Da.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque el PSA tiene estructura lineal o ramificada.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el PSA es PEG.

6. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el PSA es APS.

7. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo está inmovilizado sobre una resina.

Figura 1