Partículas de vector para dirigirse a células CD34+.

Una partícula de vector lentivírico para transferir uno o más ácidos nucleicos a células CD34+,

en laque dicha partícula de vector comprende al menos:

- una primera proteína que comprende una fusión de los dominios transmembrana y extracelular de la glicoproteínade la envoltura del virus RD114 endógeno felino y el dominio citoplásmico de la glicoproteína de la envoltura A delvirus de la leucemia murina, y

- una segunda proteína que comprende un ligando del receptor de c-Kit, siendo dicho ligando del receptor 10 de c-Kit lacitocina del factor citoblástico (SCF).

en el que la partícula de vector no comprende la glicoproteína de la envoltura G del virus de la estomatitis vesicular(VSV).

Partículas de vector para dirigirse a células CD34+

La presente invención se refiere a partículas de vector lentivírico previstas para la administración específica de ácidos nucleicos a cédulas CD34+.

Para la corrección mediante terapia génica de muchos defectos heredados o adquiridos del sistema hematopoyético, el gen terapéutico debe administrarse a células capaces tanto de autorrenovarse como de 10 diferenciarse en todos los linajes hematopoyéticos. De esta forma, estas terapias génicas deben dirigirse a las células “correctas”, es decir, los hemocitoblastos (HSC) , sin modificar sus propiedades. La población de elección para dirigirse a las HSC está constituida por células progenitoras CD34+, que están particularmente enriquecidas en estos citoblastos. Sin embargo, las células CD34+, por ejemplo, representan solo un 0, 001% de las células totales de la sangre. De acuerdo con esto, para evitar las etapas incómodas de la extracción celular, el cultivo en presencia de múltiples factores de crecimiento o adyuvantes de la transducción, y la infusión en el paciente, las partículas de vector tienen que mostrar una especificidad muy alta hacia las células CD34+, con el fin de permitir la transducción de las células CD34+ en muestras corporales no purificadas, tales como muestras de sangre, o para asegurar una eficaz transducción in vivo de las células CD34+ a pesar de la dilución de las partículas de vector.

De esta manera Sandrin y col. (2002) Blood 100: 823-832 han establecido que las partículas de vector derivadas del Virus de la inmunodeficiencia de Simios (VIS) que expresan una glicoproteína de la envoltura quimérica, RDTR, constituida por la fusión de los dominios transmembrana y extracelulares de la glicoproteína de la envoltura del virus RD114 endógeno felino y el dominio citoplásmico de la glicoproteína de la envoltura A del virus de la leucemia murina. Dichas partículas de vector se dan a conocer también en el documento WO 03/91442. Cuando se utiliza un adyuvante de la transducción, tal como RetroNectin®, la velocidad de la transducción obtenida mediante las partículas de vector que presentan la proteína RDTR quimérica es aproximadamente la misma velocidad que la observada con las partículas de vector derivadas de VIS que expresan la glicoproteína de la envoltura Gel Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV) . Sin embargo, en ausencia de adyuvante de la transducción, las partículas del vector RDTR presentan una transducción mucho menor de las células CD34+ aisladas que los vectores que presentan la glicoproteína VSV-G. A pesar de esto, no se ha mostrado una particular selectividad hacia las células CD34+ que se encuentre asociada a RDTR, ya que las partículas del vector que expresan esta proteína quimérica transducen las células CD34+ y los linfocitos de sangre periférica con aproximadamente la misma eficacia.

En otro intento de dirigirse a las células CD34+, Verhoeyen y col. (2005) Blood 106: 3386-3395 han creado partículas de vector derivadas de VIH-1 que expresan la glicoproteína de la envoltura G de VSV y las citocinas denominadas de acción temprana, concretamente, la trombopoyetina (TPO) y el factor citoblástico (SCF) . Los autores han mostrado de esta manera que estas partículas de vector proporcionaron una transducción eficaz de células CD34+ aisladas. Sin embargo, no se podría evidenciar especificidad directora de estas partículas de vector.

De acuerdo con esto, es un objeto de la presente invención proporcionar partículas de vector que sean más eficaces que las de la técnica anterior para dirigirse específicamente a células CD34+.

Resumen de la invención 45 [0006] La presente invención surge del descubrimiento, realizado por los inventores, de que la expresión simultánea de RDTR y SCF en partículas de vector derivadas de VIH tenía efectos sinérgicos inesperados sobre la eficacia y la especificidad de la transducción de las células CD34+. De forma ventajosa, dichas partículas de vector que no son dependientes de RetroNectin® para conseguir la transducción pueden efectuar una eficaz transducción a una baja dosificación, y son capaces de transducir células CD34+ en sangre completa reciente.

La presente invención se refiere más concretamente a una partícula de vector lentivírico para transferir uno o más ácidos nucleicos a células CD34+, en la que dicha partícula de vector comprende al menos:

- una primera proteína que comprende una fusión de los dominios transmembrana y extracelulares de la

glicoproteína de la envoltura del virus RD114 endógeno felino y el dominio citoplásmico de la glicoproteína de la envoltura A del virus de la leucemia murina, y

- una segunda proteína que comprende un ligando del receptor c-Kit, siendo dicho ligando del receptor c-Kit, la citocina del factor citoblástico (SCF) .

en la que la partícula de vector no comprende la glicoproteína de la envoltura G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) .

La presente invención se refiere también al uso de (i) un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una primera proteína tal como se ha definido anteriormente, y de (ii) un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una segunda proteína tal como se ha definido anteriormente, para preparar una partícula de vector lentivírico para transferir uno o más ácidos nucleicos a células CD34+.

La presente invención se refiere además a un medicamento que comprende una partícula de vector lentivírico tal como se ha definido anteriormente como ingrediente activo.

La presente invención se refiere también al uso de una partícula de vector lentivírico tal como se ha definido anteriormente, para transferir uno o más ácidos nucleicos a células CD34+ ex vivo.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para preparar células CD34+ previsto para tratar un individuo, en el que las células CD34+ que se van a administrar al individuo se ponen en contacto in vitro con una partícula de vector lentivírico tal como se ha definido anteriormente; en el que las células se transducen por uno o más ácidos nucleicos transferidos desde la partícula de vector

lentivírico [0012] Se describen también procedimientos para el tratamiento de un individuo que necesita un tratamiento génico, en el que una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula del vector de la invención se administra al individuo. En dicho procedimiento, en una primera etapa, las células que se van a administrar al individuo se ponen en contacto con una partícula de vector de la invención, y en una segunda etapa, las células se administran al individuo.

Se describe también una proteína representada por la SEQ ID NO: 4 y un ácido nucleico que la codifica.

Breve descripción de las figuras [0014]

La Figura 1 representa el porcentaje de células CD34+ (eje vertical) transducidas por las partículas de vector

derivado de VIH que codifican PFV que expresan solo RDTR, en presencia de TPO recombinante (10 ng/ml) o SCF recombinante (50 ng/ml) , o las partículas de vector que expresan RDTR y TPOHA, o RDTR y SCFHA, en presencia (barras ampliamente sombreadas) o ausencia (barras estrechamente sombreadas) de RetroNectin®.

La Figura 2 representa el porcentaje de células CD34+ (eje vertical) transducidas por partículas de vector derivadas de VIH que codifican PFV que expresan solo RDTR, en presencia de TPO recombinante (10 ng/ml) de SCF recombinante (50 ng/ml) o partículas de vector que expresan RDTR y TPOHA, o RDTR y SCFHA, a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 (barras ampliamente sombreadas) , 2 (barras blancas) o 0, 2 (barras estrechamente sombreadas ) tal como se determinó en células HeLa.

La Figura 3 representa el porcentaje de células que expresan PFV (eje vertical) presentes en una población de PBMC aislada de sangre del cordón umbilical transducidas por partículas de vector derivadas de VIH que codifican PFV que expresan solo RDTR en presencia de SCF recombinante (50 ng/ml) , RDTR y SCFHA, VSV-G solo en presencia de SCF recombinante (50 ng/ml) o VSV-G y SCFHA, en el que las células son células CD34+ (barras estrechamente sombreadas) o células CD3+ (barras ampliamente sombreadas.

La Figura 4 representa el porcentaje (eje vertical) de células CD34+ que expresan PFV o células CD3+ presentes en sangre completa de cordón umbilical transducidas por partículas de vector derivadas de VIH que codifican PFV que expresan solo RDTR en presencia de SCF recombinante (50 ng/ml) (primera barra) , RDTR y SCFHA (segunda barra) , VSV-G solo y SCF recombinante (50 ng/ml) (tercera barra) , o VSV-G y SCFHA (cuarta barra)... [Seguir leyendo]

1. Una partícula de vector lentivírico para transferir uno o más ácidos nucleicos a células CD34+, en la que dicha partícula de vector comprende al menos:

- una primera proteína que comprende una fusión de los dominios transmembrana y extracelular de la glicoproteína de la envoltura del virus RD114 endógeno felino y el dominio citoplásmico de la glicoproteína de la envoltura A del virus de la leucemia murina, y

- una segunda proteína que comprende un ligando del receptor de c-Kit, siendo dicho ligando del receptor de c-Kit la citocina del factor citoblástico (SCF) .

en el que la partícula de vector no comprende la glicoproteína de la envoltura G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) .

2. La partícula de vector de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la primera proteína consiste en una fusión de los dominios transmembrana y extracelular de la glicoproteína de la envoltura del virus RD114 endógeno felino y el dominio citoplásmico de la glicoproteína de la envoltura A del virus de la leucemia murina.

3. La partícula de vector lentivírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la segunda proteína comprende o consiste en una fusión de una citocina del SCF e (i) el dominio del extremo N de una glicoproteína hemaglutinina, o (ii) una glicoproteína de envoltura retrovírica.

4. El uso de (i) un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una primera proteína tal como se define en la reivindicación 1 o 2, y de (ii) un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una segunda proteína como en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, para preparar una partícula de vector lentivírico para transferir uno o más ácidos nucleicos a células CD34+.

5. Un medicamento que comprende una partícula de vector lentivírico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como principio activo.

6. El uso de una partícula de lector lentivírico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para transferir uno o más ácidos nucleicos a células CD34+ ex vivo.

7. Un procedimiento para preparar células CD34+ previsto para tratar un individuo, en el que las células CD34+ que se van a administrar al individuo se ponen en contacto in vitro con una partícula de vector lentivírico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las células se transducen por uno o más ácidos nucleicos transferidos a partir de la partícula de vector lentivírico.