Nuevo transportador de arabinosa específico procedente de la levadura PICHIA SITIPITIS y sus usos.

Polipéptido, seleccionado del grupo de

a. un polipéptido, que es hasta al menos el 80 % idéntico a la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:

1y que presenta una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo, y

b. un polipéptido, que es idéntico a la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:1 5 y que presenta unafunción de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo,

siendo la pentosa preferentemente arabinosa, en particular L-arabinosa.

Nuevo transportador de arabinosa específico procedente de la levadura Pichia stipitis y sus usos 1. Resumen La presente invención se refiere a un polipéptido que presenta una nueva función de transporte de arabinosa específica, así como a ácidos nucleicos que codifican para el mismo. La invención se refiere además a células huésped, en particular cepas de levadura modificadas, que contienen los ácidos nucleicos codificantes y que expresan el polipéptido y que se integran funcionalmente en la membrana plasmática y que, por lo tanto, pueden acoger L-arabinosa. Con el uso de células huésped modificadas, que expresan otras proteínas de la ruta metabólica de la arabinosa, puede fermentarse arabinosa mediante estas células, en particular para dar etanol. Por lo tanto, la presente invención es significativa, entre otras cosas, en relación con la producción de productos bioquímicos a partir de biomasa, tal como por ejemplo bioetanol.

2. Antecedentes de la invención La levadura de cerveza, de vino y de panadería Saccharomyces cerevisiae se usa ya desde hace siglos para la producción de pan, vino y cerveza debido a su propiedad de fermentar el azúcar para dar etanol y dióxido de carbono. En la biotecnología S. cerevisiae se usa, junto a la producción de proteínas heterólogas, sobre todo en la producción de etanol para fines industriales. El etanol se utiliza en numerosos sectores de la industria como sustrato de partida para síntesis. Debido a las existencias de petróleo cada vez más escasas, al precio del petróleo en aumento y a la demanda de gasolina continuamente creciente a nivel mundial, el etanol cobra cada vez más importancia como alternativa de combustible.

Para permitir una producción de bioetanol económica y eficaz se ofrece el uso de biomasa lignocelulósica, tal como por ejemplo paja, desechos de la industria de la madera y agrícola y la parte orgánica de la basura doméstica diaria, como sustrato de partida. Ésta es por un lado muy favorable y, por otro lado, existe en gran cantidad. Los tres componentes mayores de la lignocelulosa son lignina, celulosa y hemicelulosa. La hemicelulosa, después de la celulosa, el segundo polímero más frecuente, es un heteropolímero muy ramificado. Está compuesta por pentosas (L-arabinosa, D-xilosa) , ácidos urónicos (ácido 4-O-etil-D-glucurónico, ácido D-galacturónico) y hexosas (D-manosa, D-galactosa, L-ramnosa, D-glucosa) (véase la figura 1) . La hemicelulosa, si bien puede hidrolizarse más fácilmente que la celulosa, en cambio presenta las pentosas L-arabinosa y D-xilosa, que normalmente no pueden convertirse por la levadura S. cerevisiae.

Para poder utilizar pentosas para fermentaciones, éstas deben llegar en primer lugar a la célula a través de la membrana plasmática. Aunque S. cerevisiae no puede metabolizar la D-xilosa, ésta puede alojarse en la célula. Sin embargo S. cerevisiae no tiene ningún transportador específico. El transporte tiene lugar con ayuda de los numerosos transportadores de hexosa. La afinidad de los transportadores hacia D-xilosa es en cambio claramente más baja que la afinidad hacia D-glucosa (Kotter y Ciriacy, 1993) . En levaduras que pueden metabolizar D-xilosa, tales como por ejemplo P. stipitis, C. shehatae o P. tannophilus (Du Preez y col., 1986) , existen tanto transportadores de baja afinidad no específicos, que transportan D-glucosa, como simportadores de protones de alta afinidad específicos sólo para D-xilosa (Hahn-Hagerdal y col., 2001) .

En ensayos previos pudieron encontrarse algunas levaduras, tales como por ejemplo Candida tropicalis, Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Candida shehatae, que pueden fermentar L-arabinosa de forma natural o al menos asimilarla. Sin embargo, éstas no tienen la capacidad de fermentar la L-arabinosa para dar etanol por completo o presentan sólo un rendimiento de etanol muy bajo (Dien y col., 1996) . También se sabe muy poco sobre la incorporación de L-arabinosa. En la levadura C. shehatae se parte de un simporte de protones (Lucas y Uden, 1986) . En S. cerevisiae se conoce de la galactosa permeasa Gal2, que ésta transporta también la L-arabinosa similar en la estructura a la D-galactosa (Kou y col., 1970) .

La fermentación alcohólica de pentosas en cepas de levadura de S. cerevisiae modificadas mediante biotecnología, recurriéndose entre otros a distintos genes de la cepa de levadura Pichia stipitis para la modificación genética de S. cerevisiae, se describió en los últimos años sobre todo en relación con la fermentación de xilosa.. A este respecto la ingeniería genética se concentra sobre todo en la introducción de los genes para la asimilación de xilosa inicial a partir de Pichia stipitis, una levadura que fermenta xilosa en S. cerevisiae, es decir una levadura que se utiliza tradicionalmente en la producción de etanol hexosa (Jin y col. 2004) .

Jeppson y col. (2006) describen la fermentación de xilosa mediante S. cerevisiae por medio de la introducción de una ruta metabólica de xilosa, que o bien es similar a la ruta metabólica en las levaduras Pichia stipitis y Candida shehatae, que usan naturalmente xilosa, o bien similar a la ruta metabólica bacteriana.

Katahira y col. (2006) describen hidrolizados de ácido sulfúrico de biomasa lignocelulósica, tal como astillas de madera, como material importante para la producción de bioetanol combustible. En este estudio se construyó una cepa de levadura recombinante que puede fermentar xilosa y celooligosacáridos. Para ello se integraron distintos genes en esta cepa de levadura, en concreto para la expresión intercelular de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa a partir de Pichia stipitis y xiluloquinasa a partir de S. cerevisiae así como para la presentación de beta-glucosidasa a partir de Aspergillus acleatus sobre la superficie celular. Durante la fermentación de los hidrolizados de ácido sulfúrico de astillas de madera se fermentaron completamente después de 36 horas xilosa y celooligosacáridos mediante la cepa recombinante.

Pitkanen y col. (2005) describen la obtención y caracterización de aislados de quimiostato de xilosa de una cepa de S. cerevisiae, que sobreexpresa genes que codifican para xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa de Pichia stipitis y el gen, que codifica para la xiluloquinasa endógena. Los aislados se obtuvieron a partir de cultivos de quimiostato aeróbicos sobre xilosa como única o principal fuente de carbono. En condiciones aerobias sobre medio mínimo con 30 g/l de xilosa la tasa de crecimiento del aislado de quimiostato era 3 veces mayor que la de la cepa original (0, 15 h-1 frente a 0, 05 h-1) . La tasa de incorporación de xilosa se aumentó casi 2 veces. Las actividades de las encimas clave de la ruta metabólica de la pentosa fosfato (transcetolasa, transaldolasa) se aumentaron 2 veces, mientras que las concentraciones de sus sustratos (pentosa-5-fosfatos, sedoheptulosa-7-fosfato) se redujeron de manera correspondiente.

Becker y Boles (2003) describen la ingeniería genética y la selección de una cepa de laboratorio de S. cerevisiae, que puede usar L-arabinosa para el crecimiento y fermentar para dar etanol. Esto fue posible mediante la sobreexpresión de una ruta metabólica de la L-arabinosa bacteriana, que consiste en AraA de Bacillus subtilis y AraB y AraD de Escherichia coli y sobreexpresión simultánea de la galactosa permeasa que transporta L-arabinosa en la cepa de levadura. El análisis molecular de la cepa seleccionada mostró que el requisito decisivo para un uso de L-arabinosa es una menor actividad de L-ribuloquinasa. Sin embargo, de esta cepa de levadura se informa, entre otras cosas, de un crecimiento muy lento. (Véase la figura 2)

Es decir, en el estado de la técnica existe la necesidad de transportadores de pentosa específicos, en particular transportadores de L-arabinosa, que permitan captar pentosas, en particular L-arabinosa de manera específica en células, tales como células de levadura, y por lo tanto favorecer la utilización y la fermentación de pentosas, en particular L-arabinosa.

Por lo tanto es objetivo de la presente invención proporcionar transportadores de pentosa específicos, tales como transportadores de L-arabinosa.

Este objetivo se alcanza mediante la invención, tal como se reivindica en las reivindicaciones.

El objetivo se alcanza según la invención mediante la provisión de polipéptidos que presentan una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo, y variantes y fragmentos de los mismos.

El polipéptido según la invención se selecciona del grupo de

a. un polipéptido, que es al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 % idéntico a la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:1 y que presenta una función de transporte... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido, seleccionado del grupo de

a. un polipéptido, que es hasta al menos el 80 % idéntico a la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1 y que presenta una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo, y

b. un polipéptido, que es idéntico a la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:1 y que presenta una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo,

siendo la pentosa preferentemente arabinosa, en particular L-arabinosa.

2. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un fragmento de al menos 200 o 300 aminoácidos continuos según la SEQ ID NO: 1, que presenta una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo, comprendiendo preferentemente un fragmento de 502 aminoácidos, que corresponde a los primeros 502 aminoácidos según la SEQ ID NO: 1 y que presenta una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo, y/o siendo el polipéptido hasta al menos el 90 %, preferentemente el 95 % idéntico a la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1 y presentando una función de transporte de pentosa in vitro y/o in vivo, y/o que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas, siendo la pentosa preferentemente arabinosa, en particular L-arabinosa.

3. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, procediendo el polipéptido de una levadura, preferentemente de Pichia, en particular Pichia stipitis.

4. Molécula de ácido nucleico aislada, que codifica para un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el ácido nucleico es preferentemente hasta al menos el 90 %, preferentemente el 95 % y más preferentemente el 99 % idéntico a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO:2 o 3, comprendiendo la molécula de ácido nucleico preferentemente ADNbc, ADNmc, PNA, CNA, ARN o ARNm o combinaciones de los mismos.

5. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además secuencias de ácido nucleico de vector, preferentemente secuencias de vector de expresión, preferentemente que comprende además secuencias de ácido nucleico, que codifican para polipéptidos heterólogos adicionales, comprendiendo la molécula de ácido nucleico preferentemente ADNbc, ADNmc, PNA, CNA, ARN o ARNm o combinaciones de los mismos.

6. Célula huésped, que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 y que preferentemente expresa la misma, que es preferentemente una célula de hongo y más preferentemente una célula de levadura, tal como Saccharomyces sp., Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. o Yarrowia sp.

7. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 6, que contiene además moléculas de ácido nucleico, que codifican para proteínas de la ruta metabólica de la arabinosa, codificando las moléculas de ácido nucleico preferentemente para proteínas de la ruta metabólica de la arabinosa bacteriana.

8. Célula huésped de la cepa MKY06-4P, que se depositó el 23 de agosto de 2006 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares con el número de depósito DSM 18544.

9. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que comprende una parte inmunológicamente activa, que se une de manera selectiva a un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3.

10. Procedimiento para la producción de un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 8 en condiciones en las que la se expresa molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 o 5.

11. Procedimiento para la identificación de un compuesto que se une a un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 y/o que modula su actividad, que comprende las etapas de:

poner en contacto un polipéptido o una célula, que expresa un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, con un compuesto de prueba, y determinar si el polipéptido se une al compuesto de prueba y, opcionalmente, determinar si el compuesto de prueba modula la actividad del polipéptido, siendo el compuesto preferentemente una pentosa, tal como por ejemplo arabinosa, y en particular L-arabinosa,

o un derivado de una pentosa de este tipo.

12. Procedimiento para la modulación de la actividad de un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende poner en contacto un polipéptido o una célula, que expresa un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, con un compuesto, que se une al polipéptido en una concentración suficiente para modular la actividad del polipéptido, siendo el compuesto preferentemente una pentosa, tal como por ejemplo arabinosa, y en particular L-arabinosa, o un derivado de una pentosa de este tipo.

13. Procedimiento para la producción de bioetanol, que comprende la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 o 5, en una célula huésped de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 8.

14. Uso de un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 o 5 o de una célula huésped de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 10 a 8 para la producción de bioetanol y/ o para la fermentación recombinante de biomaterial que contiene pentosa.