Nuevo conjunto de regiones HCDR3 y utilizaciones de las mismas.

Una conjunto de regiones H-CDR3 diversas de anticuerpos humanos de intervalos variables de aminoácidos,

en donde la diversidad del conjunto se genera por: diversificación de regiones H-CDR3 que tienen una longitudcomprendida dentro de un primer intervalo de aminoácidos de acuerdo con un primer factor de diversidad,diversificación de regiones H-CDR3 que tienen una longitud dentro de un segundo intervalo 5de aminoácidos deacuerdo con un segundo factor de diversidad, y diversificación de regiones H-CDR3 que tienen una longitud dentrode un tercer intervalo de aminoácidos de acuerdo con un tercer factor de diversidad, en donde dichos factores dediversidad son diferentes,

en donde dicha primer intervalo de aminoácidos es de 4 a 7 aminoácidos, en donde dicho segundo intervalo deaminoácidos es de 8 a 14 aminoácidos, y en donde dicho tercer intervalo de aminoácidos es de 15 a 23aminoácidos, y

en donde dicho primer intervalo de aminoácidos tiene una composición como se representa en la Tabla 4, dichosegundo intervalo de aminoácidos tiene una composición como se representa en la Tabla 9, y dicho tercer intervalode aminoácidos tiene una composición como se representa en la Tabla 14.

Nuevo conjunto de regiones HCDR3 y utilizaciones de las mismas.

Antecedentes de la Invención

La tercera región determinante de la complementariedad de la cadena pesada de inmunoglobulina (H-CDR3)

constituye el centro del sitio clásico de fijación de antígeno y juega a menudo un papel dominante en la determinación de la especificidad y afinidad del anticuerpo. En todas las especies conocidas con un sistema inmune adaptativo, H-CDR3 es más diversa que cualquiera de las otras cinco regiones CDR (H-CDR1, H-CDR2, L-CDR1, L-CDR2 o L-CDR3) que, juntas, forman el borde exterior del sitio de fijación de antígeno (Tonegawa, 1983; Chothia et al., 1989) .

Se ha encontrado que tanto la longitud media de H-CDR3 como el intervalo de longitudes de H-CDR3, que pueden tener gran influencia en la gama de estructuras de fijación de antígeno disponibles para las especies y por consiguiente la función del repertorio de anticuerpos (Johnson & Wu, 1998; Collis et al., 2003) , aumenta de los ratones a los humanos y a ganado vacuno (Wu et al., 1993) . La diversidad de H-CDR3 puede estar regulada también dentro de una especie. Por ejemplo, en el hombre y el ratón, la gama de longitudes de H-CDR3 y la diversidad de H-CDR3 aumenta durante la ontogenia (Feeney, 1992, Zemlin et al., 2002) .

Debido a su papel prominente en la fijación de antígeno, la región H-CDR3 ha sido utilizada como vehículo para la introducción de hipervariabilidad en bibliotecas de anticuerpos sintéticos, que pueden utilizarse para la transformación por ingeniería genética de anticuerpos terapéuticos (Knappik et al., 2000) . La aleatorización de esta región con cebadores degenerados produce una diversidad enorme de secuencias, pero muchas, sino la mayoría,

de estas estructuras están distorsionadas y no son funcionales (Zemlin et al., 2003) . Por consiguiente, se requieren bibliotecas de anticuerpos sintéticos muy grandes para obtener afinidades satisfactorias contra una diana dada.

Zemlin observó que las regiones H-CDR3 en humanos exhiben una mayor gama de longitudes comparadas con las regiones H-CDR3 murinas, después del análisis por Zemlin de regiones H-CDR3 publicadas, singulares y funcionales murinas y humanas. Zemlin observó también que la frecuencia de ciertos aminoácidos cambia a medida que aumenta la longitud de la H-CDR3. Por ejemplo, Zemlin consignó que la frecuencia de serina aumentaba con la longitud para secuencias de 8-14 residuos de aminoácidos, pero exhibía un patrón mixto en secuencias más largas que 14 residuos de aminoácidos.

Recientemente, Hoet et al., Nature Biotech 23: (3) , marzo 2005, describieron la construcción de una biblioteca de anticuerpos que contenía secuencias variables pesadas (VH) que eran parcialmente sintéticas, pero contenían regiones HCDR3 capturadas de donantes humanos. En particular, la porción de la cadena VH que no incluye la región HCDR3 (FR1-H-CDR1-FR2-H-CDR2-FR3) se obtuvo sintéticamente y se incorporó en un gen VH; y la porción de la cadena VH que incluye la región HCDR3 (H-CDR3-FR4) se derivaba de pacientes autoinmunes humanos existentes naturalmente.

Hoet optó por incorporar secuencias HCDR3 capturadas de donantes humanos sobre la base de que un grado similar de diversidad funcional de biblioteca y por consiguiente de calidad, no podría conseguirse por incorporación de una región HCDR3 creada sintéticamente en una cadena VH. Esto no era sorprendente, dado que otros han elegido el enfoque de generar las así llamadas bibliotecas HCDR3 enfocadas (véase, v.g., la solicitud de patente publicada US 2006/0257937A1) , en la cual la diversidad está controlada (por limitación del análisis a segmentos V, D y J conocidos) en un esfuerzo para reducir la concentración de ligantes no funcionales que, con arreglo al saber

convencional, se espera que sea alta en las bibliotecas que están orientadas a incluir la mayor diversidad posible, haciendo con ello el cribado de las bibliotecas más complicado de lo que tendría que ser (véase la solicitud de patente ‘937A1) . De hecho, Hoet indicó no sólo que en los anticuerpos humanos existentes naturalmente, HCDR3 varía desde 4 a más de 35 residuos y tiene una diversidad de secuencia no aleatoria, sino también que es imposible sintetizar DNA que codifique a la vez la secuencia y la diversidad de longitud encontradas en los repertorios de H

CDR3 naturales. A este fin, Hoet pretende describir el uso de una biblioteca de HCDR3 dado a conocer en la solicitud de patente ‘937A1 indicando que los segmentos D de la línea germinal han sido seleccionados para fomentar el plegado y la fijación apropiados de los miembros de la biblioteca HCDR3, y que es deseable la inclusión de segmentos D en una biblioteca. Un resultado práctico de una biblioteca enfocada expuesta en la solicitud de patente ‘937A1, consistente en que la misma está construida con vistas a un conjunto de datos limitado, a saber los 50 segmentos conocidos V, D y J, es que aquélla no consigue obtener una diversidad óptima de diversificación para cada residuo de aminoácidos.

En contraste con la doctrina de Hoet y la solicitud de patente ‘937A1, la presente invención proporciona, inter alia, un conjunto de regiones H-CDR3 de anticuerpos sintéticos humanos que tienen una diversidad esencialmente como la encontrada en los repertorios naturales de H-CDR3, mimetizando la distribución natural de aminoácidos por sesgo 55 de la distribución aleatoria completa de aminoácidos en la secuencia de DNA codificante de H-CDR3. En este sentido, la invención proporciona una biblioteca de anticuerpos que está construida de una manera que se creía hasta ahora imposible de construir.

Sumario de la Invención La invención proporciona un conjunto de regiones H-CDR3 diversas de anticuerpos humanos, en las cuales la diversidad del conjunto se genera por diversificación de regiones H-CDR3 que tienen una longitud comprendida dentro de un primer intervalo de aminoácidos de acuerdo con un primer factor de diversidad, por diversificación de 5 regiones H-CDR3 que tienen una longitud comprendida dentro de un segundo intervalo de aminoácidos de acuerdo con un segundo factor de diversidad y por diversificación de regiones H-CDR3 que tienen una longitud dentro de un tercer intervalo de aminoácidos de acuerdo con un tercer factor de diversidad, en donde los factores de diversidad son diferentes, y en donde dicho primer intervalo de aminoácidos es de 4 a 7 aminoácidos, el segundo intervalo de aminoácidos es de 8 a 14 aminoácidos, y el tercer intervalo de aminoácidos es de 15 a 23 aminoácidos, y en donde dicho primer intervalo de aminoácidos tiene una composición como la representada en la Tabla 4, dicho segundo intervalo de aminoácidos tiene una composición como la representada en la Tabla 9 y dicho tercer intervalo de aminoácidos tiene una composición como la representada en la Tabla 14.

La presente invención proporciona también un conjunto de diversos anticuerpos humanos o fragmentos funcionales de los mismos, que comprende un conjunto de cadenas pesadas variables de anticuerpos humanos que comprende un conjunto de diversas regiones H-CDR3 de anticuerpos humanos de acuerdo con la presente invención.

Se describe también en esta memoria una biblioteca sintética de anticuerpos humanos, que comprende un conjunto de diversos anticuerpos humanos o fragmentos funciones de los mismos que comprenden un conjunto de cadenas pesadas variables de anticuerpos humanos de acuerdo con la presente invención.

La invención se refiere también a un conjunto de ácidos nucleicos que codifican un conjunto de regiones H-CDR3 de 20 anticuerpos humanos diversos de acuerdo con la presente invención.

Se describe también un método de obtención de un conjunto de diversas regiones H-CDR3 de anticuerpos humanos de longitudes variables que comprenden la expresión del conjunto de ácidos nucleicos.

En el contexto de la presente invención, debe entenderse que una o más posiciones de aminoácidos en una región H-CDR3 diversa por lo demás pueden mantenerse constantes. El operario experto apreciará que para la eficiencia de la síntesis de mixturas de trinucleótidos a fin de introducir diversidad dentro de las regiones H-CDR3 y para eficiencia de clonación de las diversas regiones H-CDR3 diversificadas, puede ser deseable insertar una o más posiciones constantes dentro de la región H-CDR3.

Se describe también en esta memoria un conjunto de diversas regiones H-CDR3 humanas, en donde si los miembros del conjunto tienen una longitud de 4 a 8 aminoácidos, entonces el o los factores de diversidad que se 30 aplican a dichos miembros que tienen dicha longitud de 4 a 8 aminoácidos definen 0, 1, 2 ó 3 posiciones... [Seguir leyendo]

1. Una conjunto de regiones H-CDR3 diversas de anticuerpos humanos de intervalos variables de aminoácidos, en donde la diversidad del conjunto se genera por: diversificación de regiones H-CDR3 que tienen una longitud comprendida dentro de un primer intervalo de aminoácidos de acuerdo con un primer factor de diversidad,

diversificación de regiones H-CDR3 que tienen una longitud dentro de un segundo intervalo de aminoácidos de acuerdo con un segundo factor de diversidad, y diversificación de regiones H-CDR3 que tienen una longitud dentro de un tercer intervalo de aminoácidos de acuerdo con un tercer factor de diversidad, en donde dichos factores de diversidad son diferentes,

en donde dicha primer intervalo de aminoácidos es de 4 a 7 aminoácidos, en donde dicho segundo intervalo de aminoácidos es de 8 a 14 aminoácidos, y en donde dicho tercer intervalo de aminoácidos es de 15 a 23 aminoácidos, y

en donde dicho primer intervalo de aminoácidos tiene una composición como se representa en la Tabla 4, dicho segundo intervalo de aminoácidos tiene una composición como se representa en la Tabla 9, y dicho tercer intervalo de aminoácidos tiene una composición como se representa en la Tabla 14.

2. Una conjunto de diversos de anticuerpos humanos o fragmentos funcionales de los mismos, que comprende un conjunto de cadenas pesadas variables de anticuerpo humano que comprenden un conjunto de diversas regiones HCDR3 de anticuerpos humanos de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una conjunto de ácidos nucleicos que codifica un conjunto de diversas regiones H-CDR3 de anticuerpos humanos de acuerdo con la reivindicación 1.

Entramado 2Entramado 3a Entramado 3bEntramado 4

Entramado 1