Modificación de la biosíntesis de flavonoides en plantas.

Ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico purificado o aislado que codifica para una proteína de pigmento de antocianina púrpura 1 (PAP1),

o un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico que codifica para una secuencia que es complementaria o antisentido con respecto a una secuencia que codifica para una proteína PAP1, incluyendo dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) secuencias mostradas en las figuras 1 y 4 en el presente documento (ID de secuencia n.os: 1 y 3,respectivamente);

(b) complementos de las secuencias mencionadas en (a);

(c) fragmentos funcionalmente activos de las secuencias mencionadas en (a) y (b), que pueden modificar la biosíntesis de flavonoides en una planta y que tienen un tamaño de al menos 60 nucleótidos;

(d) variantes funcionalmente activas de las secuencias mencionadas en (a) y (b) que pueden modificar la biosíntesis de flavonoides en una planta y que tienen al menos el 90% de identidad con la secuencia mencionada en (a) o (b).

Modificación de la biosíntesis de flavonoides en plantas La presente invención se refiere de manera general a fragmentos de ácido nucleico y a sus secuencias de aminoácidos codificadas para enzimas para la biosíntesis de flavonoides en plantas, y al uso de los mismos para la modificación de la biosíntesis de flavonoides en plantas.

Los flavonoides constituyen una familia relativamente diversa de moléculas aromáticas que se derivan de fenilalanina y malonil-coenzima A (CoA, mediante la ruta de ácidos grasos) . Estos compuestos incluyen seis subgrupos principales que se encuentran en la mayoría de las plantas superiores: las chalconas, las flavonas, los flavonoles, los flavandioles, las antocianinas y las taninas condensadas (o proantocianidinas) . Un séptimo grupo, las auronas, está ampliamente extendido, pero no es ubicuo.

Algunas especies vegetales también sintetizan formas especializadas de flavonoides, tales como los isoflavonoides que se encuentran en legumbres y un pequeño número de plantas no leguminosas. De manera similar, el sorgo y el maíz están entre las pocas especies que se sabe que sintetizan 3-desoxiantocianinas (o flobafenos en la forma polimerizada) . Los estilbenos, que están estrechamente relacionados con los flavonoides, se sintetizan por otro grupo de especies no relacionadas que incluye la uva, el cacahuete y el pino.

Además de proporcionar pigmentación a flores, frutas, semillas y hojas, los flavonoides también tienen papeles clave en la señalización entre plantas y microbios, en la fertilidad de machos de algunas especies, en la defensa como agentes antimicrobianos y agentes disuasorios de la alimentación, y en la protección frente a UV.

Los flavonoides también tienen actividades significativas cuando los ingieren animales, y hay un gran interés en sus posibles beneficios para la salud, particularmente para compuestos tales como isoflavonoides, que se han asociado con beneficios anticancerígenos, y estilbenos que se cree que contribuyen a una reducción de la cardiopatía.

Las rutas de ramificación principales de la biosíntesis de flavonoides comienzan con el metabolismo general de fenilpropanoides y conducen a los nueve subgrupos principales: las chalconas incoloras, las auronas, los isoflavonoides, las flavonas, los flavonoles, los flavandioles, las antocianinas, las taninas condensadas y los pigmentos de flobafeno. La enzima fenilalanina amoniaco liasa (PAL) de la ruta general de fenilpropanoides conducirá a la producción de ácido cinámico. La cinamato-4-hidroxilasa (C4H) producirá ácido p-cumárico que se convertirá, mediante la acción de la 4-cumaroil:CoA-ligasa (4CL) , en la producción de 4-cumaroil-CoA y malonil-CoA.

En la ruta de fenilpropanoides, la chalcona sintasa (CHS) usa malonil CoA y 4-cumaril CoA como sustratos. La chalcona reductasa (CHR) equilibra la producción de 5-hidroxilo o 5-desoxiflavonoides. La siguiente enzima, la chalcona isomerasa (CHI) , cataliza el cierre de anillo para formar una flavanona, pero la reacción también puede producirse de manera espontánea. Enzimas adicionales en la ruta son: flavanona 3-hidroxilasa (F3H) , dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) , flavonoide 3’-hidroxilasa (F3’H) y flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa (F3’5’H) .

En la ramificación de la ruta de fenilpropanoides que es específica para la producción de taninas condensadas y antocianinas, pueden reducirse leucoantocianidinas para dar catequinas mediante leucoantocianidina reductasa (LAR) o para dar antocianidinas mediante leucoantocianidina dioxigenasa (LDOX) . Las antocianidinas pueden convertirse en antocianinas mediante la adición de grupos azúcar, o en epicatequinas mediante antocianidina reductasa (ANR) , codificada por el gen banyuls. Las catequinas y epicatequinas son las subunidades de taninas condensadas (CT) , que se piensa que en Arabidopsis se transportan en la vacuola mediante una proteína de tipo transportador secundario de múltiples fármacos, testa transparente 12 (TT12) , y se polimerizan mediante un mecanismo desconocido.

Se ha encontrado que las enzimas en la ruta de flavonoides se controlan mediante una gama de factores de transcripción en Arabidopsis, maíz y petunia. En Arabidopsis, la biosíntesis de taninas condensadas requiere la función de testa transparente 2 (TT2) , un factor de la familia de myb, testa transparente 8 (TT8) , un factor de la familia de myc y testa transparente glabra 1 (TTG1) , un factor de la familia de WD40, entre otros factores de transcripción. Se piensa que estas tres proteínas forman un complejo de transcripción que activa de manera coordinada múltiples enzimas de la ruta de flavonoides con el fin de fomentar la producción de taninas condensadas en semillas de Arabidopsis. Otros factores de transcripción de la familia de myc y myb regulan distintas partes de la ruta de flavonoides en maíz, petunia y otras especies vegetales.

El pigmento de antocianina púrpura 1 (PAP1) de Arabidopsis thaliana pertenece a la familia de los factores de transcripción de tipo myb, incluyendo an2 (Petunia hybrida) y ant1 (Lycopersicon esculentum) , que controlan la producción de antocianinas en plantas. PAP1 regula de manera positiva la producción de antocianinas en el follaje de Arabidopsis induciendo de manera transcripcional siete enzimas de la ruta de flavonoides comunes a la biosíntesis de flavonoides y de taninas condensadas, concretamente, PAL, 4CL, CHS, CHI, F3H, DFR y LDOX.

Aunque se han aislado secuencias de ácido nucleico que codifican para factores de transcripción de tipo PAP1 para determinadas especies de plantas, sigue existiendo la necesidad de materiales útiles para modificar la biosíntesis de flavonoides; para modificar la unión de proteínas, quelación de metales, antioxidación y absorción de luz UV; para modificar la producción de pigmentos de la planta; para modificar la defensa de la planta frente a estreses bióticos tales como virus, microorganismos, insectos, patógenos fúngicos; para modificar la calidad del forraje, por ejemplo alterando la espuma de proteínas y confiriendo protección en cuanto a la inflamación de la panza por el pasto, particularmente en hierbas y legumbres de forraje, incluyendo alfalfa, medicagos, tréboles, centenos y festucas, y de métodos para su uso.

Un objeto de la presente invención es superar, o al menos aliviar, una o más de las dificultades o deficiencias asociadas con la técnica anterior o ayudar a cumplir las necesidades mencionadas anteriormente.

La invención proporciona un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico purificado o aislado que codifica para una proteína de pigmento de antocianina púrpura 1 (PAP1) , o un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico que codifica para una secuencia que es complementaria o antisentido con respecto a una secuencia que codifica para una proteína PAP1, incluyendo dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) secuencias mostradas en las figuras 1 y 4 en el presente documento (ID de secuencia n.os: 1 y 3, respectivamente) ;

(b) complementos de las secuencias mencionadas en (a) ;

(c) fragmentos funcionalmente activos de las secuencias mencionadas en (a) y (b) , que pueden modificar la biosíntesis de flavonoides en una planta y que tienen un tamaño de al menos 60 nucleótidos;

(d) variantes funcionalmente activas de las secuencias mencionadas en (a) y (b) que pueden modificar la biosíntesis de flavonoides en una planta y que tienen al menos el 90% de identidad con la secuencia mencionada en (a) o (b) .

La invención también proporciona un polipéptido de PAP1 purificado o aislado que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) secuencias mostradas en las figuras 2 y 5 en el presente documento (ID de secuencia n.os: 2 y 4, respectivamente) ; y

(b) variantes funcionalmente activas de las secuencias mencionadas en (a) que tienen una o más de las propiedades biológicas de PAP1 y que tienen al menos el 90% de identidad con ID de secuencia n.º: 2 o ID de secuencia n.º: 4.

La presente descripción también proporciona ácidos nucleicos o fragmentos de ácido nucleico sustancialmente purificados o aislados que codifican para secuencias de aminoácidos para una clase de proteínas que están relacionadas con PAP1, o fragmentos funcionalmente activos o variantes de las mismas. Tales proteínas se denominan en el presente documento de tipo PAP1.

Por un polipéptido de tipo PAP1 quiere decirse que se aplica uno cualquiera de ambos de los siguientes criterios: (i) el gen que codifica para el polipéptido se expresa de una manera similar a PAP1, y (ii)... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico purificado o aislado que codifica para una proteína de pigmento de antocianina púrpura 1 (PAP1) , o un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico que codifica para una secuencia que es complementaria o antisentido con respecto a una secuencia que codifica para una proteína PAP1, incluyendo dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) secuencias mostradas en las figuras 1 y 4 en el presente documento (ID de secuencia n.os: 1 y 3, respectivamente) ;

(b) complementos de las secuencias mencionadas en (a) ;

(c) fragmentos funcionalmente activos de las secuencias mencionadas en (a) y (b) , que pueden modificar la biosíntesis de flavonoides en una planta y que tienen un tamaño de al menos 60 nucleótidos;

(d) variantes funcionalmente activas de las secuencias mencionadas en (a) y (b) que pueden modificar la biosíntesis de flavonoides en una planta y que tienen al menos el 90% de identidad con la secuencia mencionada en (a) o (b) .

2. Ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que dichas variantes funcionalmente activas tienen al menos el 95% de identidad con la secuencia mencionada en (a) o (b) .

3. Ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico según la reivindicación 1, incluyendo dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en (a) secuencias mostradas en las figuras 1 y 4 en el presente documento (ID de secuencia n.os: 1 y 3, respectivamente) y (b) complementos de las secuencias mencionadas en (a) .

4. Ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico según la reivindicación 1, incluyendo dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en las figuras 1 y 4 en el presente documento (ID de secuencia n.os: 1 y 3, respectivamente) .

5. Constructo que incluye un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Vector que incluye un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

7. Vector según la reivindicación 6, que incluye además un promotor y un terminador, estando dicho promotor, ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico y terminador operativamente unidos.

8. Vector según la reivindicación 6 ó 7, que incluye además un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico que codifica para ANR (banyuls) .

9. Célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta, que incluye un constructo según la reivindicación 5

o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8.

10. Planta, semilla de planta u otra parte de planta derivada de una célula vegetal o planta según la reivindicación 9 y que incluye un constructo según la reivindicación 5 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8.

11. Método de modificación de

(a) la biosíntesis de flavonoides en una planta,

(b) la quelación de metales, antioxidación y/o absorción de luz UV en una planta,

(c) la producción de pigmentos en una planta,

(d) la defensa de la planta frente a un estrés biótico, o

(e) la calidad del forraje de una planta, incluyendo dicho método introducir en dicha planta una cantidad eficaz de un ácido nucleico o fragmento de ácido

nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un constructo según la reivindicación 5 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho estrés biótico se selecciona del grupo que consiste en virus, microorganismos, insectos y patógenos fúngicos.

13. Uso de un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y/o información de secuencia de nucleótidos del mismo, y/o polimorfismos de un único nucleótido del mismo como marcador genético molecular.

14. Polipéptido de PAP1 purificado o aislado que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) secuencias mostradas en las figuras 2 y 5 en el presente documento (ID de secuencia n.os: 2 y 4, respectivamente) ; y

(b) variantes funcionalmente activas de las secuencias mencionadas en (a) que tienen una o más de las propiedades biológicas de PAP1 y que tienen al menos el 90% de identidad con ID de secuencia n.º: 2 o ID de secuencia n.º: 4.

15. Polipéptido según la reivindicación 14, incluyendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID de secuencia n.º: 2 e ID de secuencia n.º: 4.

16. Polipéptido purificado o aislado codificado por un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

17. Método de potenciación de la calidad del herbaje y/o seguridad en cuanto a la inflamación en una planta,

incluyendo el método sobreexpresar PAP1 y ANR (banyuls) en dicha planta de una manera secuencial, simultánea o combinada, e incluyendo el método introducir en dicha planta uno o más ácidos nucleicos o fragmentos de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y uno o más ácidos nucleicos o fragmentos de ácido nucleico que codifican para ANR (banyuls) .

18. Método según la reivindicación 17, en el que dicha planta es una planta de pasto.