Microvesículas derivadas de levadura recombinante con actividades hemostáticas y usos de las mismas.

Una microvesícula derivada de levadura portadora de factor tisular (FT) que tiene actividad procoagulante que comprende (i) una membrana de levadura y (ii) una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma con actividad procoagulante,

en la que una porción de dicha proteína factor tisular (FT) o un fragmento de la misma con actividad procoagulante está integrada en dicha membrana, en donde dicha microvesícula es obtenible mediante un procedimiento que comprende:

(a) someter a fermentación un cultivo de células recombinantes de levadura que expresan la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante;

(b) sedimentar el producto que resulta de la etapa a) de fermentación, para obtener un producto de fermentación;

(c) someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un homogeneizado de fermentación; y

(d) someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un pellet y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante;

(e) recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante y,

(f) aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante.

Microvesículas derivadas de levadura recombinante con actividades hemostáticas y usos de las mismas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, en general, al tratamiento de hemorragias en un sujeto con un agente procoagulante. Más específicamente, la invención se refiere a microvesículas derivadas de levadura portadoras de factor tisular que comprenden una membrana de levadura y una proteína factor tisular, o un fragmento de la misma,

o una proteína factor tisular o un fragmento de la misma fusionada a otro péptido como proteína de fusión con actividad procoagulante y a sus aplicaciones como agente procoagulante útil en el tratamiento de hemorragias en un sujeto así como en la promoción de la angiogénesis y la migración celular. La invención además se refiere a procedimientos para la producción de dicha microvesícula derivada de levadura portadora de factor tisular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La hemostasis es el mecanismo mediante el cual los seres vivos responden a una hemorragia e implica la participación de dos procesos que funcionan inmediatamente después de una lesión y que permanecen activos durante un largo periodo de tiempo. El primero de ellos se conoce como hemostasis primaria y se caracteriza por la aparición de vasoconstricción en el lugar de la lesión vascular y por la formación de agregados plaquetarios. El segundo se conoce como hemostasis secundaria y es la fase en la cual se forma el coágulo de fibrina por la acción de los diferentes enzimas proteolíticos de la cascada de coagulación.

En la segunda fase del proceso de coagulación sanguínea participan varios cofactores y enzimas proteolíticos, todos ellos conocidos como factores de coagulación, y consiste en varias fases que terminan con la formación de fibrina a partir de la hidrólisis del fibrinógeno gracias a la acción de la trombina. La trombina se forma previamente por la hidrólisis proteolítica de un apoenzima, la protrombina. El factor X de coagulación activado (FXa) lleva a cabo la proteólisis, uniéndose a la superficie de las plaquetas activadas y, sólo en presencia de su cofactor, el factor de coagulación V activado (FVa) , y de iones de calcio, es capaz de hidrolizar la protrombina. La activación del factor X de coagulación (FX) se puede producir por dos vías separadas, la vía intrínseca y la vía extrínseca.

La vía intrínseca consiste en una serie de reacciones en las que cada proenzima se hidroliza produciendo su forma proteasa activa. En cada etapa, el enzima proteolítico recién formado catalizará la activación de la siguiente proenzima para producir sucesivamente la forma activa.

En la vía extrínseca de coagulación sanguínea, el factor tisular (FT) , expuesto sobre las células adventicias en el lugar de la lesión, se une al factor VII de coagulación/factor VII de coagulación activado (FVII/FVIIa) circulante para formar el complejo FT::FVIIa y, en presencia de calcio, actuar como sustrato de modo que tenga lugar la activación del FX. Actualmente, la vía extrínseca se considera la más importante en la coagulación sanguínea y se acepta que en el caso de una hemorragia producida por una lesión vascular, la coagulación se desencadene debido a la activación de la vía extrínseca, lo que supone la interacción del FT con su ligando, FVII/FVIIa.

El FT consiste en un componente proteico (denominado anteriormente apoproteína-III del factor tisular) y un fosfolípido. El FT se une específicamente al FVII/FVIIa y tiene una función importante en la vía extrínseca de coagulación sanguínea. Las funciones fisiológicas asignadas al FT son bien conocidas, por un lado, es un receptor específico del FVIIa y, una vez formado el complejo FT::FVIIa, actúa como sustrato para que tenga lugar de este modo la activación del FX. De hecho, después de una lesión vascular, el FT, que normalmente está secuestrado en la superficie de las células adventicias que rodean externamente a los vasos sanguíneos, se pone en contacto e interacciona con su ligando, el FVII presente en la sangre, para formar el complejo FT::FVII. Una vez formado este complejo, tiene lugar la autoactivación del FVII, produciendo su forma activa (FVIIa) .

La glucosilación es un proceso específico del sitio dirigido por enzimas en el que se añaden sacáridos a lípidos y a proteínas. Se cree que este proceso está implicado en la estabilidad, plegamiento y transporte, aunque no se ha descrito ninguna evidencia de su función real para FT.

Se ha aceptado en general que el FT es el elemento principal responsable de la rapidez con la que se inicia la coagulación. Para que se inicie la coagulación es absolutamente necesario que el FX esté activado y comience la hidrólisis de la protrombina. La fuente de este FXa se ha atribuido principalmente a la interacción del FVIIa con su receptor, el FT.

Se ha descrito la purificación del FT a partir de diversos tejidos como: cerebro humano, cerebro bovino, placenta humana, cerebro ovino y pulmón. Está ampliamente aceptado que aunque existen diferencias en cuanto a la estructura de la proteína FT entre especies, no existen diferencias funcionales cuando se mida mediante ensayos de coagulación in vitro.

Está ampliamente aceptado que para mostrar actividad biológica, el FT debe estar asociado con fosfolípidos in vitro. Se ha demostrado que la eliminación del componente fosfolipídico del FT, por ejemplo, mediante el uso de una fosfolipasa, da lugar a la pérdida de su actividad biológica in vitro. La relipidación puede restablecer la actividad del FT in vitro.

Aunque se ha dispuesto de ciertas cantidades de proteína FT "purificada" cuando se obtiene de los diversos tejidos, la baja concentración de proteína FT en la sangre y en tejidos y el elevado coste, tanto económico como de esfuerzo, de la purificación de la proteína a partir de tejidos, hace de éste un material escaso. Por tanto, existe una necesidad de buscar una fuente alternativa de proteína FT, de forma ventajosa, una proteína FT lipidada.

La proteína FT se ha expresado en diversos sistemas utilizando el ADNc humano clonado. Así, se ha publicado la sobreexpresión de la proteína FT en E. coli (Paborsky y col., Biochemistr y 28, 8072 (1989) ) . Además, la patente US con el número 6.261.803 describe un procedimiento para la preparación de FT recombinante funcional en un organismo hospedador procariota. En E. coli se consigue un alto rendimiento de expresión de la proteína FT completa.

Aunque la expresión heteróloga de proteínas en E. coli presenta algunas ventajas, la expresión de proteínas eucariotas en dicha bacteria se asocia con un gran número de problemas, principalmente cuando la proteína que se desea expresar es una proteína eucariota glucosilada, debido a la falta de sus propios sistemas de glucosilación en la bacteria.

Una estrategia alternativa consiste, por tanto, en expresar una proteína FT mutada que carece del dominio transmembrana. Este FT llamado "soluble" (o FT "truncado") se acumula en el citoplasma de las células bacterianas y puede expresarse en cantidades relativamente grandes. Sin embargo, en este sistema, la proteína FT expresada de este modo normalmente está presente en E. coli en un estado cuasicristalino en la forma de los llamados cuerpos de inclusión. Cuando es este el caso, los cuerpos de inclusión se han de solubilizar mediante el uso de grandes cantidades de agentes caotrópicos y las proteínas, que se han monomerizado de esta forma, tienen que plegarse de nuevo, con mucho esfuerzo y normalmente sólo con un bajo rendimiento, para dar la conformación activa renaturalizada. Además, en principio, el FT soluble no es adecuado para su uso en reactivos para tiempo de protrombina puesto que carece del dominio de interacción con fosfolípidos.

Otra aproximación para la sobreexpresión de la proteína FT es el uso de un gran número de sistemas de expresión conocidos y empleados con éxito que codifican productos de fusiones de genes (por ejemplo, con 1-galactosidasa, MalE, glutatión transferasa, His-tag, etc.) . Sin embargo, estos sistemas no son adecuados para la expresión de FT biológicamente activo. Aunque pueden detectarse productos de expresión y también puede incrementarse el nivel de expresión cuando se usan dichos sistemas, los productos de expresión obtenidos de este modo se asocian a veces con una pérdida completa de función, que no puede restablecerse, ni incluso usando incluso procedimientos de renaturalización elaborados.

Los problemas de sobreexpresión de la proteína FT en E. coli pueden superarse realizando la expresión de dicha proteína en un sistema eucariota. De este modo, la expresión en células de levadura, en cultivos de células... [Seguir leyendo]

1. Una microvesícula derivada de levadura portadora de factor tisular (FT) que tiene actividad procoagulante que comprende (i) una membrana de levadura y (ii) una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma con actividad procoagulante, en la que una porción de dicha proteína factor tisular (FT) o un fragmento de la misma con actividad procoagulante está integrada en dicha membrana, en donde dicha microvesícula es obtenible mediante un procedimiento que comprende:

(a) someter a fermentación un cultivo de células recombinantes de levadura que expresan la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante;

(b) sedimentar el producto que resulta de la etapa a) de fermentación, para obtener un producto de fermentación;

(c) someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un homogeneizado de fermentación; y

(d) someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un pellet y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante;

(e) recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante y,

(f) aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante.

2. Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 1, en la que dicha proteína factor FT, o una variante de la misma con actividad procoagulante, está glucosilada.

3. Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha proteína factor FT, o una variante de la misma con actividad procoagulante, es un miembro de una proteína de fusión, conteniendo dicha proteína de fusión una primera región que comprende la proteína FT, o un fragmento de la misma con actividad procoagulante, unida a una segunda región que comprende otro péptido o proteína.

4. Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 3, en la que dicha proteína de fusión comprende una proteína FT, o una variante de la misma con actividad procoagulante, y una etiqueta.

5. Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 4, en la que dicha etiqueta es una etiqueta de histidina (His-tag) .

6. Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una proteína FT madura, preferiblemente, una proteína FT madura humana.

7. Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una proteína FT truncada con actividad procoagulante en la que se ha perdido todo o parte del dominio responsable de la unión a FVIIa (aa 32 a 174) .

8. Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 7, en la que dicha proteína FT truncada comprende el dominio de interacción con el Factor X, la región transmembrana y la cola citoplasmática y carece, parcial o totalmente, del dominio responsable de la unión a FVIIa.

9. Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 8, en la que dicha proteína FT truncada comprende el dominio de interacción con el Factor X (a.

17. 251) , la región transmembrana (a.

25. 274) y la cola citoplasmática (a.

27. 295) del FT humano y una etiqueta de histidina adicional.

10. Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que FT contiene al menos un sitio de N-glucosilación no funcional.

11. Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 10, en la que dicho sitio o sitios de N-glucosilación no funcionales son aquellos que corresponden a los sitios de N-glucosilación NLT en las posiciones 11-13, NVT en las posicione.

12. 126 o NNT en las posicione.

13. 139 en el rFT maduro humano.

12. Microvesícula derivada de levadura según la reivindicación 11, en la que el FT contiene una o más mutaciones Asn a Ala en los residuos Asn en las posiciones correspondientes a las posiciones 11, 124 ó 137 en el FT maduro humano.

13. Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el dominio Nterminal de dicha proteína FT o variante de la misma con actividad procoagulante se orienta hacia el lado exoplasmático de dicha membrana.

14. Microvesícula derivada de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el dominio Nterminal de dicha proteína FT o variante de la misma con actividad procoagulante se orienta hacia el lado endoplasmático de dicha membrana.

15. Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha purificación se lleva a cabo mediante purificación por etiqueta o por cromatografía de inmunoafinidad.

16. Una composición que comprende una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

17. Microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 15, para su uso como medicamento.

18. Una composición farmacéutica que comprende una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso en el tratamiento de hemorragias en un sujeto.

20. Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según la reivindicación 19 para su uso en el tratamiento tópico de hemorragias en un sujeto.

21. Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso en el tratamiento de una enfermedad que requiere promocionar la migración celular y/o la angiogénesis en un sujeto, en donde dicha enfermedad se selecciona de miocardio isquémico, infarto de miocardio, cardiomiopatía isquémica, claudicación de una isquemia límbica crónica, ulceración/gangrena isquémica/dolor en reposo, neuropatía/derrame cerebral isquémico, penumbra isquémica cerca del derrame cerebral/infarto, placa aterosclerótica inestable/ulcerada en arterias coronaria/carótida, trombosis aguda o crónica arterial y/o venosa, cicatrización de herida, derrame cerebral isquémico y hemorrágico, lesiones traumáticas y úlceras.

22. Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT para su uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la herida se selecciona de heridas corneales, quemaduras, abrasiones, incisiones quirúrgicas, sitios donantes de injerto, lesión en un lumen corporal tal como vaso sanguíneo, arteria, arteria coronaria, vena, lumen esofágico y uretra; lesiones causadas por agentes infecciosos; lesiones en piel y superficie epitelial causadas por una infección o afección inflamatoria persistente; lesiones en piel y superficie epitelial causadas por un defecto genético tal como formación de queloide y anormalidades en coagulación.

23. Una microvesícula derivada de levadura portadora de FT para su uso según la reivindicación 21, en donde la úlcera se selecciona de úlceras en piernas, llagas de cama, úlcera venosa crónica, úlcera diabética, úlcera por compresión, llagas por presión y úlceras o llagas de la superficie mucosa.

24. Un procedimiento para la producción de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante y que comprende (i) una membrana de levadura y (ii) una proteína factor tisular (FT) o una variante de la misma con actividad procoagulante, en la que una porción de dicha proteína factor tisular (FT) o un fragmento de la misma con actividad procoagulante está integrada en dicha membrana, que comprende:

(a) someter a fermentación un cultivo de células recombinantes de levadura que expresan la proteína FT o un fragmento de la misma con actividad procoagulante en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína FT, o fragmento de la misma con actividad procoagulante;

(b) sedimentar el producto que resulta de la etapa a) de fermentación, para obtener un producto de fermentación;

(c) someter dicho producto de fermentación de la etapa b) a homogeneización, para obtener un homogeneizado de fermentación; y

(d) someter dicho homogeneizado de fermentación de la etapa c) a separación, para obtener un pellet y un extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante;

(e) recoger dicho extracto de levadura clarificado (CYE) que contiene dicha microvesícula derivada de levadura portadora de FT con actividad procoagulante; y

(f) aislar o purificar dichas microvesículas derivadas de levadura portadoras de FT con actividad procoagulante.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha purificación se realiza mediante purificación por etiqueta o mediante cromatografía de afinidad.

26. Un procedimiento para la preparación de microvesículas que comprenden una proteína de membrana de interés, en la que dicha proteína de interés es rFT, un fragmento del mismo o un mutante de N-glicosilación del mismo, a partir de una célula de levadura que comprende las etapas de:

(a) hacer crecer un cultivo de dicha célula de levadura en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína de membrana de interés,

(b) someter la fracción celular del cultivo de a) a homogenización,

(c) someter el homogeneizado obtenido en la etapa b) a separación, para obtener un pellet y un extracto celular clarificado que contiene dichas microvesículas derivadas celulares que contienen la proteína de membrana de interés, y

(d) purificar dichas microvesículas derivadas celulares mediante fraccionamiento por tamaño usando filtración de flujo tangencial y/o usando filtros de membrana que retienen microvesículas que con un diámetro de 0, 1 a 0, 2 µm.

27. Procedimiento según la reivindicación 26 que comprende una etapa adicional de concentración mediante cromatografía de exclusión por tamaños o una etapa adicional de purificación mediante cromatografía de afinidad usando un ligando que muestra afinidad por la proteína de membrana de interés.

28. Uso de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de hemorragias en un sujeto.

29. Uso según la reivindicación 28 en el que la microvesícula derivada de levadura portadora de FT se administra tópicamente.

30. Uso de una microvesícula derivada de levadura portadora de FT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad que requiere promocionar la migración celular y/o la angiogénesis en un sujeto, en donde dicha enfermedad se selecciona de miocardio isquémico, infarto de miocardio, cardiomiopatía isquémica, claudicación de una isquemia límbica crónica, ulceración/gangrena isquémica/dolor en reposo, neuropatía/derrame cerebral isquémico, penumbra isquémica cerca del derrame cerebral/infarto, placa aterosclerótica inestable/ulcerada en arterias coronaria/carótida, trombosis aguda

o crónica arterial y/o venosa, cicatrización de herida, derrame cerebral isquémico y hemorrágico, lesiones traumáticas y úlceras.

31. Uso según la reivindicación 30, en el la herida se selecciona de heridas corneales, quemaduras, abrasiones, incisiones quirúrgicas, sitios donadores de injerto, lesión en un lumen corporal tal como un vaso sanguíneo, arteria, arteria coronaria, vena, lumen esofágico y uretra; lesiones causadas por agentes infecciosos; lesiones en piel y superficie epitelial causadas por una infección o afección inflamatoria persistente; lesiones en piel y superficie epitelial causadas por un defecto genético tal como formación de un queloide y anormalidades en coagulación.

32. Uso según la reivindicación 30, en el que la úlcera se selecciona de úlceras en piernas, llagas de cama, úlcera venosa crónica, úlcera diabética, úlcera por compresión, llagas por presión y úlceras o llagas de la superficie mucosa.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

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Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citada en la descripción