Microorganismos eucariotas para producir lípidos y antioxidantes.

Un microorganismo eucariota que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos un97 % de identidad con la secuencia expuesta en SEC ID Nº 1,

en donde el microorganismo es capaz de producir unacomposición lipídica, en donde la composición lipídica comprende el 15 % en peso de fracción de ácidos grasos deDHA n-3, el 4 % en peso de fracción de ácidos grasos de DPA n-6 y el 1 % en peso de fracción de ácidos grasos deEPA n-2.

Microorganismos eucariotas para producir lípidos y antioxidantes I. Antecedentes Hay pruebas científicas abrumadoras de que los ácidos grasos altamente insaturados (n-3) , tales como el ácido docosahexaenoico (DHA) , tienen un efecto positivo en enfermedades cardio-circulatorias, inflamaciones crónicas y trastornos cerebrales. Por otro lado, los ácidos grasos (n-6) se han observado como metabolitos intermedios dentro de los esteroides eicosanoides, tales como prostaglandinas, leucotrienos o similares.

En la actualidad, la principal fuente de estos ácidos grasos altamente insaturados es el pescado, habiéndose observado DHA y ácido eicosapentaenoico (EPA) en diversos pescados azules (tales como sardinas y atún) en cantidades de aproximadamente 20 % y 10 %, respectivamente. Sin embargo, si se pretende usar aceite de pescado como la única fuente de estos lípidos, existen diversas desventajas, tales como problemas de contaminación del sabor, fluctuaciones incontrolables en cuanto a la disponibilidad, variabilidad del contenido de aceite de pescado natural, así como la posibilidad de acumular sustancias contaminantes ambientales perjudiciales. Además, si se pretende obtener un aceite altamente purificado (n-3) o (n-6) de estas fuentes, es muy difícil separar y purificar de modo preferencial.

En la base de datos de EMBL se depositó una secuencia de nucleótidos de una parte de un gen de ARN ribosómico de subunidad pequeña de Thraustochytrium striatum con el número de referencia AF265338.

El documento EP 0 823 475 A1 desvela la producción de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) por Schizochytrium limacinum SR21, en el que el microorganismo descrito en el mismo produce ácidos grasos en una cantidad de entre 30, 3 y 58 % por biomasa celular seca. La fracción de ácido graso contiene DHA en cantidades que superan el 25 %. El microorganismo produce ácidos grasos que contienen EPA 0, 4-0, 8 %, DPA 8, 4-11, 1 % y DHA 34-43, 7 %. El documento EP 0 823 475 A1 también desvela complementos nutricionales, productos alimentarios y formulaciones farmacéuticas que comprenden dicha composición de ácidos grasos.

II. Sumario Se desvelan composiciones y métodos relacionados con un eucariota del orden Thraustochytriales y la familia Thraustochytriaceae que cuando se cultivan producen cantidades de ácidos grasos insaturados, tales como ácidos omega 3 (n-3) y/u omega 6 (n-6) , tales como DHA, EPA y DPA, que pueden purificarse y usarse como se usan todas estas composiciones y más, debido a su medio de producción.

III. Breve descripción de los dibujos Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de la presente memoria descriptiva, ilustran varias realizaciones y junto con la descripción ilustran las composiciones y métodos desvelados.

La Figura 1 muestra un diagrama que muestra los resultados obtenidos de la metilación de ácidos grasos de los lípidos derivados de ONC-T18.

La Figura 2 representa gráficamente una comparación de metil éster de ácido graso entre el aislado de ONC- T18 original recogido en Advocate Harbor y el del ONC-T18 de Thraustochytrium sp. depositado en la ATCC como PTA-6245. Todos los picos se identificaron por cromatografía de gases y espectrometría de masas.

La Figura 3 muestra un gráfico de representación de dispersión de resultados de experimentos de optimización de biomasa ONC-T18 realizados. Estos experimentos usaron una técnica conocida como el método de Taguchi para determinar las condiciones óptimas para el crecimiento de ONC-T18 en diversas condiciones de medios.

La Figura 4 muestra un gráfico de barras del perfil de ácidos grasos de ONC-T18, cultivado en condiciones óptimas (ejemplo 4) durante un periodo de nueve días.

La Figura 5 muestra un diagrama de organismos productores de aceite aislados como se describe en cualquier parte en el presente documento.

La Figura 6 muestra un árbol filogenético ramificado de la relación entre el gen de ARNr 18S de ONC-T18 y otros Thraustochytriales.

La Figura 7 muestra la producción de lípidos y DHA de ONC-T18 en diferentes condiciones.

La Figura 8 muestra un gráfico modificado con información acerca de las condiciones de cultivo en él para los eucariotas desvelados en el presente documento. (Modificado de Ratledge, C. (2004) , lLipid. Technol. 16:3439) .

La Figura 9 muestra una ruta metabólica propuesta para la producción de PUFA para los eucariotas desvelados.

La Figura 10 muestra una comparación de producción de ácidos grasos máxima y composiciones en diversas fuentes de carbono de bajo coste, alternativas.

La Figura 11 muestra un agrupamiento de aislados recogidos basándose en sus perfiles de PUFA C20 y C22. Los resultados se compararon con dos cepas de referencia: ATCC 20891 y MYA-1381.

La Figura 12 muestra un árbol de unión de vecinos de ARNr 18S de la cepa ONC-T18. La barra representa la distancia genética, mientras que los corchetes representan secuencias derivadas de GenBank usadas dentro de este árbol filogenético. La Figura 13 muestra el perfil de ácidos grasos de ONC-T18 cultivado en medio que contiene extracto de levadura 2 g l-1, L-glutamato 8 g l-1, sal marina 6 g l-1 y glucosa 60 g l-1 en 3 tipos de fermentación diferentes: placa de agar (agar 1, 5 %, 25 ºC, 27 días) , matraces (50 ml en matraz de 250 ml, 120 RPM, 25 °C, 3 días) y biorreactor de 5 l (aire 4 lpm, pO2 90 %, 25 °C, 3 días) . La Figura 14 muestra el cromatograma de HPLC de compuestos carotenoides aislados de Thraustochytrium sp. ONC-T18. Por ejemplo, se aislaron Astaxantina, Zeaxantina, Cantaxantina, Equinenona y !-Caroteno de Thraustochytrium sp. ONC-T18. La Figura 15 muestra biomasa típica, producción de ácidos grasos totales (TFA) , DHA y utilización de glucosa de Thraustochytrium sp. ONC-T18 mantenido en un biorreactor de 5 l durante 168 h con medio compuesto de glucosa 60 g l-1, extracto de levadura 2 g l-1, ácido glutámico 8 g l-1 y sal 6 g l-1 (aire 4 lpm, pO2 90 %, 25 ºC, pH 7-9) . La Figura 16 muestra rutas hipotéticas implicadas en la formación de astaxantina en Thraustochytrium sp. ONC-T18.

IV. Descripción detallada Antes de desvelar y describir los presentes compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos, debe entenderse que no se limitan a métodos de síntesis específicos o a métodos de biotecnología recombinante específicos a no ser que se especifique de otro modo, o a reactivos particulares a no ser que se especifique de otro modo, ya que estos pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es con el único fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante.

Los expertos en la materia reconocerán, o podrán determinar usando tan solo experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas del método y composiciones descritos en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes queden incluidos en las reivindicaciones posteriores.

A. Definiciones Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen los referentes plurales, a no ser que el contexto indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un vehículo farmacéutico” incluye mezclas de dos o más de dichos vehículos, y similares.

Los intervalos pueden expresarse en el presente documento como de “aproximadamente” un valor particular y/o “aproximadamente” otro valor particular. Cuando se expresa dicho intervalo, otra realización incluye desde un valor particular y/o al otro valor particular. De forma similar, cuando se expresan valores como aproximaciones, mediante el uso del antecedente “aproximadamente”, se entenderá que el valor particular forma otra realización. También se entenderá que los extremos e cada uno de los intervalos son significativos ambos en relación con el otro extremo, e independientemente del otro extremo. También debe entenderse que hay diversos valores desvelados en el presente documento, y que cada valor también se desvela en el presente documento como “aproximadamente” ese valor particular además del valor en sí mismo. Por ejemplo, si se desvela el valor “10”, entonces también se desvela “aproximadamente 10”. También se entiende que cuando se desvela un valor que es “menor que o igual a” el valor, “mayor que o igual al valor” y posibles intervalos entre valores también se desvelan, como entiende apropiadamente el experto en la materia. Por ejemplo, si se desvela el valor “10” entonces también se desvela “menor que o... [Seguir leyendo]

1. Un microorganismo eucariota que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos un 97 % de identidad con la secuencia expuesta en SEC ID Nº 1, en donde el microorganismo es capaz de producir una composición lipídica, en donde la composición lipídica comprende el 15 % en peso de fracción de ácidos grasos de DHA n-3, el 4 % en peso de fracción de ácidos grasos de DPA n-6 y el 1 % en peso de fracción de ácidos grasos de EPA n-2.

2. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es del filo Labyrinthulomycota. 10

3. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es de la clase Labyrinthulamycetes.

4. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es de la subclase Thraustochytridae.

5. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es del orden Thraustochytriales.

6. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es de la familia Thraustochytriaceae.

7. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es del género Thraustochytrium. 20

8. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es Thraustochytrium sp.

9. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en

Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum y Thraustochytrium striatum. 25

10. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es del género Schizochytrium.

11. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es Schizochytrium sp.

12. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo comprende un ácido graso omega 3 u omega 6.

13. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo comprende DHA, EPA o DPA.

14. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo produce una composición lipídica por biomasa celular seca de al menos aproximadamente el 30 % en peso.

15. El microorganismo de la reivindicación 14, en el que el lípido comprende DHA.

16. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es de la familia Thraustochytriaceae y tiene el número de referencia de ATCC PTA-6245.

17. Una composición que comprende un microorganismo eucariota como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16. 45

18. Un método para preparar una composición lipídica, comprendiendo el método: cultivar el microorganismo eucariota de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 en un medio heterotrófico y aislar la composición lipídica.

19. Un dispositivo de suministro que comprende una composición de la reivindicación 17. 50

20. Un complemento nutricional que comprende la composición de la reivindicación 17 o el dispositivo de suministro de la reivindicación 19.

21. Un producto alimentario que comprende la composición de la reivindicación 17, el dispositivo de suministro de la 55 reivindicación 19 o el complemento nutricional de la reivindicación 20.

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