MÉTODOS Y PRODUCTOS PARA EL DIAGNÓSTICO IN VITRO, PRONÓSTICO IN VITRO Y DESARROLLO DE FÁRMACOS CONTRA CARCINOMAS INVASIVOS.

Métodos y productos para el diagnóstico in vitro, pronóstico in vitro y desarrollo de fármacos contra carcinomas invasivos.

La presente invención se refiere a métodos y productos in vitro para detectar la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, para determinar y/o pronosticar el estadio y/o la invasividad de dicho carcinoma en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho carcinoma basados en la expresión del gen col11a1 y de la proteína proCOL11A1. La invención también se refiere a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia de dicho carcinoma, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos. La invención también se refiere a agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína proCOL11A1 y/o los efectos de esta expresión.

Métodos y productos para el diagnóstico in vitro, pronóstico in vitro y desarrollo de fármacos contra carcinomas invasivos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos y productos in vitro para detectar la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, para determinar y/o pronosticar el estadío y/o la invasividad de dicho carcinoma en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho carcinoma. La invención también se refiere a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia de dicho carcinoma, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos. La invención también se refiere a agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína proCOL11A1, y/o los efectos de esta expresión.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El Cáncer es uno de los principales problemas de salud pública a escala mundial. Según la base de datos GLOBOCAN, de la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer, perteneciente a la Organización Mundial de la Salud, más de 10 millones de casos de cáncer se diagnosticaron en todo el mundo durante el año 2000, y el número de muertes debidas al cáncer el año 2.000 fue superior a 6 millones de personas.

A pesar de todos los avances que se han producido en los últimos 20 años, el cáncer es todavía una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Durante estos años se ha avanzado con éxito en la prevención y el tratamiento de estadíos tempranos de muchas de las distintas enfermedades que se engloban en este término. Sin embargo muy pocos han sido los avances en el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico o de tratamiento de estadíos avanzados e invasivos de la enfermedad.

Las células tumorales durante el proceso de malignización cambian su patrón de expresión génica, lo que altera procesos celulares, tales como el mantenimiento de la arquitectura celular, la adhesión, la muerte y la proliferación celular. Estas modificaciones no sólo generan cambios en las propias células, sino que hacen que algunas células del estroma reciban señales moleculares alteradas y cambien su pauta de comportamiento y su patrón de expresión génica, adquiriendo una morfología típica de miofibroblastos. Las moléculas secretadas por estos miofibroblastos en respuesta al tumor adyacente pueden a su vez contribuir de diferente manera a promover el crecimiento e invasión tumoral, de manera que se establece un bucle paracrino entre tumor y estroma. En los últimos años, se han generado evidencias científicas que apuntan cada vez con mayor precisión hacia el estroma peritumoral, como uno de los principales promotores de la invasividad tumoral, así como de fenómenos de resistencia a terapia.

Los métodos y productos para diagnóstico y terapia que los autores de la presente invención reivindican, se enmarcan en este novedoso marco de investigación, ya que se basan en la explotación del gen col11a1 y de la proteína proCOL11A1, presente en células del estroma de carcinomas invasivos, como potencial marcador y/o diana terapéutica para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de estos carcinomas.

Un carcinoma invasivo es una neoplasia maligna compuesta por células epiteliales que infiltran y destruyen los tejidos que las rodean; en general, se trata de tumores malignos que, en su crecimiento, infiltran y rompen la lámina basal dando lugar a metástasis. Ejemplos ilustrativos de carcinomas invasivos incluyen el cáncer de páncreas, el carcinoma renal, el carcinoma transicional de vejiga, el carcinoma bronquioalveolar, y el cáncer de mama, entre otros. A diferencia de otros tumores, lo sorprendente del cáncer de páncreas es su homogeneidad clínica fenotípica. El comportamiento clínico del cáncer de páncreas es homogéneo y siempre infausto, sin diferencias notables en la supervivencia según el estadío. El número de pacientes con cáncer de páncreas de buen pronóstico es insignificante. Una posible explicación es que incluso en pacientes con tumores pequeños, encuadrados en el estadío I, la enfermedad está diseminada. Su diagnóstico en una fase inicial, salvo en casos fortuitos, es difícil; un 75% de los pacientes diagnosticados presentan enfermedad avanzada (Estadíos III y IV) . Se trata de una neoplasia muy agresiva, resistente a los tratamientos citostáticos y sólo entre un 1 y un 4% de los casos permanecen vivos a los cinco años del diagnóstico, siempre que el tumor esté localizado y haya podido ser extirpado en su totalidad (Warshaw A.L., and Fernandes.del Castillo C., N. Eng. J. Med., 1992, 326:455-465; Ahlgren J.D., Semin. Oncol. 1996, 23:241-250) . El adenocarcinoma ductal de páncreas fue la causa de más de138.000 muertes en el mundo, y de más de 2.600 en España, durante el año 2.008 (GLOBOCAN) . Por todo ello, en el caso del cáncer de páncreas, tanto el desarrollo de sistemas de diagnóstico precoz como el de terapias eficaces, resultan cruciales para el control de la enfermedad (Byungwoo R., et al., Cancer Res., 2002, 62:819-826) .

En el caso del carcinoma renal, el 50-60% de los pacientes diagnosticados desarrollan metástasis, y el 90-95% de estos pacientes que han desarrollado metástasis muere durante los 5 años siguientes al diagnóstico (Rabinovitch R.A., et al., J. Clin. Oncol., 1994, 12:206-212; Sandock, D.S., et al., J. Urol, 1995, 154:28-31) . El carcinoma renal fue la causa de más de 72.000 muertes en el mundo, y de más de 1.200 en España, durante el año 2.008

(GLOBOCAN) . Avances en el conocimiento de la Genética del cáncer de riñón han permitido la clasificación de distintos tipos de tumores renales. El subtipo más común es el carcinoma convencional de células renales, que es diferente de los subtipos papilar, cromófobo o ductal colector. El oncocitoma renal es una neoplasia benigna, indistinguible en ocasiones del carcinoma renal, que es una neoplasia maligna. Estudios previos han demostrado que todos estos subtipos histológicos son distintos genética y biológicamente, y que tanto su morfología como comportamiento están determinados por factores moleculares distintivos (Kovacs G., et al., J. Pathol., 1997, 183:131-133) , pero todavía no hay ningún marcador que se haya demostrado útil en ensayos clínicos. El tratamiento del carcinoma renal es extremadamente difícil por su capacidad de extenderse sin producir síntomas, por su inherente resistencia a la quimioterapia sistémica convencional y por la incapacidad de la radioterapia para reducir los niveles de recaída tras la nefrectomía, incluso en pacientes con afectación nodal o tumores no reseccionados completamente (Kjaer M., et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1987, 13:665-672) . Esto hace necesario el desarrollo de aproximaciones terapéuticas alternativas, para tratar los carcinomas renales con mayor eficacia.

El carcinoma transicional de vejiga fue la causa de más de 1.120.000 muertes en el mundo, y de más de 3.400 en España, durante el año 2.008 (GLOBOCAN) . Los carcinomas de vejiga se gradúan desde G1 hasta G3 según la OMS (Organización Mundial de la Salud) , por estado decreciente de diferenciación celular y creciente de agresividad de la enfermedad. Respecto al estadío, o invasividad, los carcinomas de células transicionales (TCCs) de vejiga se clasifican en superficial con y sin afectación de la lámina propria (Ta y T1) , infiltrante de capas profundas (T2 a T4) y el poco común Carcinoma in situ o tumor in situ (TIS) . Los tumores de bajo grado (G1) están normalmente confinados a la mucosa o infiltran capas superficiales (estadío Ta y T1) . Nuevos sistemas de diagnóstico precoz son necesarios dado que el 80-90% de los pacientes en estadío T2 o mayor, son diagnosticados de novo en ese estadío de gran agresividad y no en estadíos previos (de Vere White, R.W. and Stapp, E., Oncology, 1998, 12:1717-1723) . El pronóstico de los pacientes afectados de carcinoma transicional de vejiga invasivo es malo; el 50% de estos pacientes en estadío T2 o mayor, desarrolla metástasis distantes durante los 2 años posteriores al diagnóstico, y el 69% muere durante los 5 años posteriores al diagnóstico, incluso habiendo recibido tratamiento. Son necesarias aproximaciones terapéuticas alternativas para tratar el carcinoma transicional de vejiga invasivo muscular con una mayor eficiencia; también son necesarias aproximaciones terapéuticas alternativas para tratar tumores superficiales de una forma más eficiente que la cirugía, o para complementarla, con el fin de evitar la recidiva y la progresión de tumores a invasividad.

El carcinoma bronquioloalveolar (CBA) , también denominado carcinoma de células acinares es un subtipo de adenocarcinoma pulmonar con características suficientemente... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para detectar la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, para determinar o pronosticar la malignidad, la invasividad, el estadío y/o la severidad de dicho carcinoma en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho carcinoma, que comprende:

a) la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 en una muestra de dicho individuo;

b) la comparación de la presencia y/o cantidad de dicha proteína proCOL11A1 detectada en dicha muestra de dicho individuo con la cantidad de proteína proCOL11A1 detectada en una muestra control; y

c) correlacionar el resultado obtenido con la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, la determinación o pronóstico de la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo, o la monitorización del efecto de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma invasivo;

con la condición de que dicho carcinoma a detectar no es adenocarcinoma ductal infiltrante de mama ni adenocarcinoma ductal pancreático;

o, alternativamente a) la detección y/o cuantificación del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo;

b) la comparación de la cantidad de mRNA del gen col11a1 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en dicha muestra de dicho individuo, con la cantidad del mRNA del gen col11a1 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra control; y

c) correlacionar el resultado obtenido con la presencia de un carcinoma invasivo en un individuo, la determinación o pronóstico de la malignidad, invasividad, estadío y/o severidad de dicho carcinoma invasivo en dicho individuo, o la monitorización del efecto de la terapia administrada a dicho individuo que presente dicho carcinoma invasivo;

con la condición de que dicho carcinoma a detectar no es carcinoma de vejiga y de que dicho carcinoma cuya invasividad se desea conocer no es cáncer de mama, colon, pulmón u ovario.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho carcinoma invasivo se selecciona del grupo formado por carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha muestra es una muestra de tejido, preferiblemente de tejido de riñón, vejiga, páncreas, colon, pulmón, o cabeza o cuello.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicha muestra de tejido a analizar se obtiene mediante biopsia, cistoscopia o resección quirúrgica.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra es una muestra de bilis, exudado de flujo gástrico, heces, orina, plasma, líquido ascítico, líquido cefalorraquídeo (LCR) , líquido peritoneal, líquido pleural, líquido sinovial, orina, saliva, sangre, semen o suero,

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha muestra a analizar es una muestra seleccionada entre:

una muestra de un individuo al que no se le ha diagnosticado previamente un carcinoma;

una muestra de un individuo al que se le ha diagnosticado previamente un carcinoma; y

una muestra de un individuo en tratamiento, o que ha sido tratado previamente, contra un carcinoma.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, además, la obtención a partir de dicha muestra de un extracto de proteínas o de un extracto que comprende RNA total.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la detección de la proteína proCOL11A1 comprende poner en contacto el extracto de proteínas de la muestra con un anticuerpo específico contra la proteína proCOL11A1 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo anticuerpo-proteína proCOL11A1.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo específico contra la proteína proCOL11A1 es un anticuerpo que reconoce un epítopo situado en el dominio VAR del extremo N-terminal de la proteína proCOL11A1.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, que comprende, además, la detección y/o cuantificación del complejo anticuerpo-proteína proCOL11A1 formado.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la detección y/o cuantificación del complejo anticuerpo-proteína proCOL11A1 formado comprende el empleo de una técnica seleccionada del grupo formado por Western-blot o transferencia Western, ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima) , RIA (Radioimmunoassay o Radioinmunoensayo) , EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay o Inmunoensayo enzimático competitivo) , DAS-ELISA (Double antibody sandwich-ELISA o ensayo ELISA sandwich con doble anticuerpo) , técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas de detección multiplex basadas en el empleo de microsferas, biochips o microarrays de proteínas que incluyen anticuerpos específicos, o ensayos basados en precipitación coloidal.

12. Método según la reivindicación 7, en el que la detección y/o cuantificación de la proteína proCOL11A1 se lleva a cabo mediante cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a lectina.

13. Método según la reivindicación 7, en el que la detección del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA comprende una primera etapa de amplificación del mRNA, incluido en el extracto de RNA total, o del correspondiente cDNA sintetizado por retrotranscripción del mRNA, incluido en el extracto de RNA total, y una segunda etapa de cuantificación del producto de la amplificación del mRNA o del cDNA del gen col11a1.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicha amplificación se realiza de manera cualitativa o cuantitativa, mediante transcripción reversa – reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en presencia de cebadores específicos del gen col11a1.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha RT-PCR se lleva a cabo en presencia de la pareja de oligonucleótidos cebadores cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

16. Método según la reivindicación 7, en el que la detección del mRNA del gen col11a1 o del correspondiente cDNA se realiza mediante sondas específicas del mRNA o del correspondiente cDNA del gen col11a1, o mediante Northern-blot o transferencia Northern.

17. Método según la reivindicación 7, en el que la detección del mRNA del gen col11a1 se efectúa mediante RT- PCR cuantitativa a tiempo real (Q-PCR) .

18. Un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, o un fragmento del mismo que mantiene la capacidad de unirse a la proteína proCOL11A1.

19. Anticuerpo según la reivindicación 19, que reconoce un epítopo situado en el dominio VAR del extremo Nterminal de la proteína proCOL11A1.

20. Un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, o un fragmento del mismo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, que comprende, dentro de la región variable de la cadena pesada (VH) , al menos una región determinante de complementariedad (CDR) seleccionada entre:

-una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 (GYSFTGYY) [CDR-H1] o una variante de la misma;

-una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 (INCYNGAT) [CDR-H2] o una variante de la misma; y

-una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 (AIWDYEFHVMDY) [CDR-H3] o una variante de la misma.

21. Anticuerpo según la reivindicación 20, que comprende, dentro de la región VH, dos de dichas CDRs seleccionadas entre las CDRs cuyas secuencias de aminoácidos comprenden las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 3 a 5.

22. Anticuerpo según la reivindicación 20, que comprende, dentro de la región VH, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 [CDR-H1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 [CDR-H2] o una variante de la misma, y una

CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H3] o una variante de la misma.

23. Anticuerpo según la reivindicación 20, que comprende, además, dentro de la región variable de la cadena ligera (VL) , al menos una CDR seleccionada del grupo formado por:

-una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 (SSVNY) [CDR-L1] o una variante de la misma;

-una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma; y

-una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 (QQFTSSPWT) [CDR-L3] o una variante de la misma.

24. Anticuerpo según la reivindicación 23, que comprende, dentro de la región VL, dos de dichas CDRs seleccionadas entre las CDRs cuyas secuencias de aminoácidos comprenden las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 6 ó 7.

25. Anticuerpo según la reivindicación 23, que comprende, dentro de la región VL, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-L1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3] o una variante de la misma.

26. Anticuerpo según la reivindicación 23, que comprende:

-dentro de la región VH, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 [CDR-H1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 [CDR-H2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 [CDR-H3] o una variante de la misma; y

-dentro de la región VL, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 [CDR-L1] o una variante de la misma, una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos YTS [CDR-L2] o una variante de la misma, y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 [CDR-L3] o una variante de la misma.

27. Anticuerpo según la reivindicación 20, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma.

28. Anticuerpo según la reivindicación 23, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma.

29. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28, que comprende:

-una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 [VH_1E8.33] o una variante de la misma, y

-una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 [Vkappa_1E8.33] o una variante de la misma.

30. Anticuerpo según la reivindicación 20, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, o un fragmento de anticuerpo que mantiene la capacidad de unirse a la proteína proCOL11A1.

31. Uso de un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, o un fragmento del mismo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 30, para el diagnóstico, pronóstico y/o diagnóstico diferencial de un carcinoma.

32. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 31 para detectar in vitro la presencia de un carcinoma, en el que dicho carcinoma se selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.

33. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 30, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un carcinoma invasivo.

34. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 33, en el que dicho carcinoma se selecciona entre carcinoma renal, carcinoma transicional invasivo de vejiga, adenocarcinoma ductal de páncreas, adenocarcinoma infiltrante de mama, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma pulmonar con patrón bronquioalveolar, carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y carcinomatosis peritoneales.

35. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de, al menos, un anticuerpo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, o un fragmento del mismo que se une específicamente a la proteína proCOL11A1, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 30, junto con un excipiente o sustancia transportadora farmacéuticamente aceptable.

36. Composición farmacéutica según la reivindicación 35, que comprende, además, un ingrediente activo adicional, preferiblemente un ingrediente activo que inhibe la función de la proteína proCOL11A1.

Figura 1

190 200 210 220 230 240

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190 200 210 220 230 240

250 260 270 280 290 300 VA1 DTAVPDTPQSQDPNPDEYYTEGDGEGETYYYEYPYYEDPEDLGKEPTPSKKPVEAAKETT :...: . :.:.:. ::: : : : ::: : : .:.. : XIA1 DSSAPKAAQAQEPQIDEYAPEDIIE---YDYEYGEAE------------YKEAESVTEGP250 260 270 280

310 320 330 340 350 360

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290 300 310 320 330

370 380 390 400 410 420

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340 350 360 370 380 390

430 440 450 460 470

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400 410 420 430 440 450

Figura 2

Figura 3

Figura 4 Figura 5

Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9

(A) (B)

Figura 10

Figura 11 Figura 12

Figura 13 Figura 14

Figura 15 Figura 16