Métodos y composiciones para la detección y análisis de interacciones de proteínas que se unen a polinucleótidos utilizando multicromóforos captadores de luz.

Método para el análisis de polinucleótidos que comprende

(a) poner en contacto una muestra con por lo menos dos componentes

- un sistema multicromóforo luminiscente captador de luz,

por ejemplo, un polímero conjugado, unaestructura de semiconductor de punto cuántico o dendrítica que es soluble en agua, y

- una proteína que se une a polinucleótido (PBP) sensor conjugada con un cromóforo de señalizaciónluminiscente ("PBP-C*"), en el que el polinucleótido diana forma un complejo con la PBP sensor;

en el que la emisión de una longitud de onda de luz característica del cromóforo C* de señalización tras la excitacióndel multicromóforo indica la presencia en solución del polinucleótido diana.

Métodos y composiciones para la detección y análisis de interacciones de proteínas que se unen a polinucleótidos utilizando multicromóforos captadores de luz

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a métodos, artículos y composiciones para la detección y análisis de polinucleótidos en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los métodos que permiten el análisis de polinucleótidos en tiempo real y con alta sensibilidad son de gran interés científico y económico.1, 2, 3 Sus aplicaciones incluyen el diagnóstico médico, la identificación de mutaciones genéticas, la monitorización de la liberación de genes y técnicas genómicas específicas.4 Los colorantes orgánicos catiónicos, tales como bromuro de etidio y naranja de tiazol, emiten cuando están intercalados en los surcos de la cadena doble de ADN (ADNds) , y sirven como sondas de hibridación directas de ADN, pero carecen de la especificidad de secuencia.5, 6 Existen parejas de cromóforos de transferencia de energía/electrones para análisis específicos de cadena, pero requieren un marcaje químico de dos ácidos nucleicos, o una doble modificación de la misma cadena alterada (por ejemplo, sondas moleculares) .7, 8 Las dificultades para etiquetar dos sitios de ADN dan lugar a bajos rendimientos, altos costes e impurezas marcadas individualmente que disminuyen la sensibilidad de detección.9

Existe la necesidad en la técnica de métodos de detección y análisis de polinucleótidos particulares en una muestra, y de composiciones y artículos de fabricación útiles en dichos métodos.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan métodos, composiciones y artículos de fabricación para la detección y el análisis de un polinucleótido diana en una muestra.

En una primera realización, se pone en contacto una muestra sospechosa de contener el polinucleótido diana con un multicromóforo policatiónico y una proteína que se une a polinucleótido (PBP) sensor que puede unirse al polinucleótido diana. La PBP sensor comprende un cromóforo de señalización. Sin desear estar limitado por la teoría, en presencia de polinucleótido diana en la muestra, se cree que el cromóforo de señalización se aproxima al multicromóforo catiónico mediante la utilización de interacciones electrostáticas con el esqueleto del polinucleótido diana unido al PBP sensor (véase la figura 1) . El cromóforo de señalización puede adquirir a continuación energía del multicromóforo policatiónico excitado y emitir luz que se puede detectar. El polinucleótido diana puede analizarse tal como se encuentra en la muestra, o se puede amplificar antes de o junto con el análisis.

Se proporcionan soluciones que comprenden reactivos útiles para realizar los métodos de la invención, como son kits que contienen dichos reactivos. Los métodos se pueden utilizar en las múltiples configuraciones en las que se utiliza una pluralidad de diferentes PBP sensor para el análisis de una pluralidad de diferentes polinucleótidos diana. Los métodos opcionalmente se pueden realizar en una superficie, por ejemplo, usando un multicromóforo policatiónico asociado a la superficie, la superficie puede ser un sensor. Los métodos también se pueden disponer en formatos homogéneos. Los métodos y artículos descritos en este documento se pueden utilizar como alternativas a otras técnicas para detectar polinucleótidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 representa el método de la invención, utilizando un polímero policatiónico como multicromóforo captador de luz. Una PBP sensor (PBP-C*) comprende un cromóforo de señalización y una especificidad de unión para el polinucleótido diana de interés. Tras ponerse en contacto el polinucleótido diana en una muestra, el multicromóforo policatiónico se aproxima al cromóforo de señalización debido a sus propias interacciones con el polinucleótido diana. La excitación del multicromóforo produce a continuación la emisión de luz del cromóforo de señalización.

La Figura 2 representa las estructuras moleculares de Tat-C* utilizadas en los ejemplos de trabajo (donde C* es la fluoresceína) , ARN de TAR y ARN de dTAR.

La Figura 3 muestra los espectros ópticos del polímero 1 y Tat-C*. Las excitaciones se realizaron a 380 nm y 480 nm para el polímero 1 y Tat-C*, respectivamente. Las condiciones de ensayo son solución tampón de TRIS EDTA (10 mM) y pH = 7, 4.

La Figura 4 muestra los espectros ópticos de oligómero 1 y Tat-C*. Las excitaciones se realizaron a 365 nm y 480

nm para el oligómero 1 y Tat-C*, respectivamente. Las condiciones de ensayo son solución tampón de TRIS EDTA (10 mM) y pH = 7, 4.

La Figura 5 muestra los espectros ópticos del oligómero 2 y Tat-C*.Las excitaciones se realizaron a 375 nm y 480 nm para el oligómero 2 y Tat-C*, respectivamente. Las condiciones de ensayo son solución tampón de TRIS EDTA (10 mM) y pH = 7, 4.

La Figura 6 muestra los espectros de emisión de Tat-C* en presencia de ARN de TAR y ARN de dTAR por excitación del oligómero 1 a 365 nm. Las condiciones son en solución tampón de TRIS EDTA (10 mM) y pH = 7, 4. Los espectros se normalizan con respecto a la emisión del oligómero 1.

La figura 7 muestra los espectros de emisión de Tat-C* en presencia de ARN de TAR y ARN de dTAR por excitación del oligómero 2 a 375 nm. Las condiciones son en solución tampón TRIS EDTA (10 mM) y pH = 7, 4. Los espectros se normalizan con respecto a la emisión del oligómero 2.

La Figura 8 muestra los espectros de emisión de Tat-C* en presencia de ARN de TAR y ARN de dTAR por excitación del polímero 1 a 380 nm. Las condiciones son en solución tampón TRIS EDTA (10 mM) y pH = 7, 4. Los espectros se normalizan con respecto a la emisión del polímero 1.

La figura 9 muestra los espectros de emisión de SH3-C* y Tat-C* en presencia de ARN de TAR por excitación del oligómero 1 a 365 nm. Las condiciones son en solución tampón TRIS EDTA (10 mM) y pH = 7, 4. Los espectros se normalizan con respecto a la emisión del oligómero 1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Las tecnologías actuales para sensores de ADN y ARN (incluyendo "chips de genes" y "chips de ADN") dependen de la unión covalente de etiquetas fluorescentes (lumóforos) a hebras individuales de ADN. La mayoría de estos sensores se ven obligados a confiar en el etiquetado de la muestra de analito, con los problemas inevitables que resultan de las variaciones en la eficacia de la reacción de marcaje de muestra a muestra, requiriendo calibraciones cruzadas complejas. Otros sistemas se basan en la estrategia de "sonda molecular", que requiere la unión de lumóforos e inhibidores a secuencias diseñadas de manera precisa.

Se proporciona un método para el análisis de polinucleótidos que comprende poner en contacto una muestra con por lo menos dos componentes: (a) un sistema multicromóforo luminiscente captador de luz, tal como, por ejemplo, un polímero conjugado, una estructura de semiconductor de punto cuántico o dendrítica que es soluble en agua, y (b) una PBP sensor conjugada con un cromóforo de señalización luminiscente ("PBP-C*") . La emisión de una longitud de onda de luz característica del cromóforo-C* de señalización tras la excitación del multicromóforo indica la presencia en la solución del polinucleótido diana. Mediante el uso de múltiples PBP sensores diferentes, cada uno con una secuencia de bases diferente y un cromóforo de señalización diferente (PBP1-C1*, PBP2-C2*, PBP3-C3*, PBP4-C4*, etc.) , se pueden detectar y analizar de manera independiente múltiples polinucleótidos diferentes.

El cromóforo captador de luz y el cromóforo de señalización (C*) se eligen de manera que las bandas de absorción de los dos cromóforos tienen un solapamiento mínimo y de manera que los espectros de emisión luminiscente de las dos especies se encuentran a diferentes longitudes de onda. Cuando se prepara en solución acuosa, el sistema multicromóforo luminiscente captador de luz está cargado positivamente, o es catiónico, y es preferiblemente policatiónico (por ejemplo, un polielectrolito conjugado policatiónico) . La PBP sensor y el multicromóforo se eligen de manera que existe una interacción mínima entre ellos en ausencia de la diana. Tras la adición de un polinucleótido diana que puede unirse a la PBP sensor, el polinucleótido diana forma un complejo con la PBP sensor. Debido a que el polinucleótido diana está cargado negativamente, la PBP sensor se asocia con el multicromóforo policatiónico, permitiendo la transferencia de energía desde el multicromóforo policatiónico al cromóforo de señalización, por ejemplo a través del mecanismo... [Seguir leyendo]

1.Método para el análisis de polinucleótidos que comprende (a) poner en contacto una muestra con por lo menos dos componentes

-un sistema multicromóforo luminiscente captador de luz, por ejemplo, un polímero conjugado, una estructura de semiconductor de punto cuántico o dendrítica que es soluble en agua, y

-una proteína que se une a polinucleótido (PBP) sensor conjugada con un cromóforo de señalización luminiscente ("PBP-C*") , en el que el polinucleótido diana forma un complejo con la PBP sensor;

en el que la emisión de una longitud de onda de luz característica del cromóforo C* de señalización tras la excitación del multicromóforo indica la presencia en solución del polinucleótido diana.

2. Método, según la reivindicación 1, que comprende

- combinar un polímero conjugado y una proteína que se une a polinucleótido sensor conjugada a un cromóforo de señalización luminiscente con una muestra sospechosa de contener un polinucleótido diana bajo condiciones en las que la proteína que se une a polinucleótido se une a la diana para formar un complejo, y

- detectar la emisión del cromóforo de señalización tras la excitación del polímero conjugado indica la formación de complejo, en el que la emisión es mayor que la obtenida de la excitación directa del cromóforo de señalización.

3. Método, según la reivindicación 1, que comprende poner en contacto una muestra con una polímero conjugado luminiscente captador de luz y una proteína que se une a polinucleótido sensor conjugada a un cromóforo de señalización luminiscente en una solución predominantemente acuosa, en el que la emisión de luz característica del cromóforo de señalización tras la excitación del polímero conjugado luminiscente indica la presencia en la muestra del polinucleótido diana, y en el que la emisión del cromóforo de señalización es mayor que la obtenida de la excitación directa del cromóforo de señalización.

4. Método, según la reivindicación 1, que comprende añadir a una muestra biológica un polímero conjugado y una proteína que se une a polinucleótido sensor conjugada a un cromóforo de señalización luminiscente; y detectar la emisión del cromóforo de señalización mediante la excitación del polímero conjugado, en el que la emisión del cromóforo de señalización es mayor que la obtenida de la excitación directa del cromóforo de señalización.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la muestra se pone en contacto con un conjunto de proteínas que se unen a polinucleótidos (PBP) diferentes, comprendiendo dichas PBP diferentes un cromóforo de señalización correspondiente diferente, en el que cada una de dichas PBP diferentes se une selectivamente a un polinucleótido diana correspondiente diferente.

6. Método, según la reivindicación 1, en el que el multicromóforo es un fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en un nanocristal semiconductor, un colorante fluorescente, una proteína verde fluorescente y un quelato de lantánido.

7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que se cuantifica la cantidad de luz emitida del cromóforo de señalización y se utiliza para determinar la cantidad del polinucleótido diana en la muestra.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la luz emitida del cromóforo de señalización por encima de un nivel umbral indica que el polinucleótido diana está presente en la muestra.

9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el método se realiza sobre un sustrato.

10. Solución de detección de polinucleótido, que comprende:

un polímero conjugado y una proteína que se une a polinucleótido (PBP) sensor que se une a un polinucleótido diana y que se conjuga a un cromóforo de señalización luminiscente, en la que el polímero conjugado es capaz de transferir energía al cromóforo de señalización tras la excitación cuando está próximo al mismo y que provoca que se emita una mayor cantidad de energía del cromóforo de señalización tras la excitación del polímero conjugado que de la excitación directa del cromóforo de señalización.

11. Kit para analizar en una muestra un polinucleótido diana, que comprende:

una proteína que se une a polinucleótido (PBP) sensor que se une al polinucleótido diana y que se conjuga a un cromóforo de señalización luminiscente, y un polímero conjugado, en el que el polímero conjugado es capaz de transferir energía al cromóforo de señalización tras la excitación cuando está próximo al mismo y que provoca que se emita una mayor cantidad de energía del cromóforo de señalización tras la excitación del polímero conjugado que de la excitación directa del cromóforo de señalización; una carcasa para contener la PBP y el polímero conjugado; y instrucciones proporcionadas con dicha carcasa que describen cómo utilizar los componentes del kit para analizar en una muestra el polinucleótido diana.

12. Complejo de transferencia de energía que comprende una proteína que se une a polinucleótido (PBP) sensor conjugada a un cromóforo de señalización luminiscente ("PBP-C*") , un polímero conjugado y un polinucleótido diana, en el que el cromóforo de señalización es capaz de recibir energía de un estado excitado del polímero conjugado.

13. Complejo de transferencia de energía, según la reivindicación 12, en el que la emisión de luz del cromóforo de señalización es más intensa cuando la luz incidente se encuentra en una longitud de onda que se absorbe por el polímero conjugado que cuando el cromóforo de señalización se excita directamente por la luz incidente.