Métodos y composiciones para la amplificación y genotificación de genomas completos.

Un método para indicar la presencia de un polimorfismo de nucleótido único (SNP) de interés en los loci tipablesde un genoma,

que comprende las etapas de:

(a) amplificar representativamente un genoma nativo para obtener una población representativa defragmentos de genoma que comprende loci tipables, teniendo cada uno una posición de interrogación quecorresponde a un SNP;

(b) poner en contacto dichos fragmentos con una matriz de diferentes sondas de ácidos nucleicosinmovilizados en condiciones en las que se forman los híbridos sonda-fragmentos,donde dichos fragmentos tienen una concentración de al menos 1 μg/μl de ADN y donde dichas sondas deácidos nucleicos inmovilizados comprenden una región que es complementaria de los loci tipables de ungenoma;

(c) poner en contacto la pluralidad de sondas de ácidos nucleicos con un inhibidor de la extensión ectópica(EEI) en condiciones en que se forman híbridos de EEI de la sonda;

(d) poner en contacto dichos híbridos sonda-fragmento con una enzima de modificación,donde si la posición de interrogación de un locus tipable contiene un SNP de interés, un resto de detección seune a la sonda hibridada; y

(e) detectar la sonda, indicando de esta forma la presencia de dichos polimorfismos de nucleótidos únicos deinterés en los loci tipables de dicho genoma;y

donde la etapa (e) detecta los híbridos sonda-fragmento selectivamente en comparación con los híbridossonda-EEI.

Métodos y composiciones para la amplificación y genotificación de genomas completos

Campo de la invención La presente invención se refiere al análisis genético en general, y más concretamente, a la amplificación de genomas completos y a la genotificación basándose en pluralidades de marcadores genéticos que abarcan genomas.

Antecedentes de la invención La mayor parte del ADN de una persona cualquiera, un 99, 9 por ciento, es exactamente igual al ADN del resto de las personas. La diferencia del aproximadamente 0, 1 % en la secuencia del genoma representa una amplia variedad de diferencias entre las personas, tales como el color de los ojos y el grupo sanguíneo. La variación genética también desempeña un papel en si una persona está en riesgo de contraer determinadas enfermedades o si una persona puede tener una respuesta favorable o adversa a un fármaco en particular. Las diferencias genéticas individuales se han asociado con un alto riesgo de adquirir una variedad de enfermedades tales como fibrosis quística y enfermedad de células falciformes. Las interrelaciones más complejas entre múltiples genes y el medio ambiente son responsables de muchos rasgos como el riesgo de padecer algunas enfermedades comunes tales como diabetes, cáncer, apoplejía, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, depresión, alcoholismo, enfermedad cardiaca, artritis y asma.

Hay disponibles ensayos de diagnóstico basados en la genética para varias enfermedades muy penetrantes causadas por un solo gen, como la fibrosis quística. Tales ensayos se pueden realizar mediante el sondeo de mutaciones o polimorfismos particulares en los respectivos genes. Por consiguiente, es posible determinar el riesgo de contraer una enfermedad en particular mucho antes de que aparezcan los síntomas y, si se desea, se pueden tomar medidas preventivas. Sin embargo, se cree que la mayoría de las enfermedades, incluyendo muchas enfermedades comunes tales como la diabetes, enfermedades cardíacas, cáncer y trastornos psiquiátricos, se ven afectadas por múltiples genes, así como por condiciones ambientales. Por lo tanto, el diagnóstico de tales enfermedades basándose en la genética es considerablemente más complejo a medida que aumenta el número de genes por estudiar.

Recientemente, a través de una variedad de esfuerzos de genotipificación, se ha identificado un gran número de marcadores polimórficos de ADN, muchos de los cuales se cree que están asociados con la probabilidad de desarrollar determinados rasgos tales como el riesgo de adquirir enfermedades conocidas. Los marcadores de ADN polimórficos a modo de ejemplo que están disponibles incluyen polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que se producen con una frecuencia media de más de un 1 por kilobase en el ADN genómico humano. Es probable que muchos de estos SNP sean variantes genéticas terapéuticamente relevantes y/o que participen en la predisposición genética a padecer una enfermedad. Sin embargo, los métodos actuales para la consulta en todo el genoma de los SNP y otros marcadores no son eficaces, convirtiendo así la identificación de conjuntos de marcadores de diagnóstico útiles en poco práctica.

El documento WO02101022 divulga un método para la genotificación de polimorfismos de un solo nucleótido usando 45 la amplificación de genomas completos y la extensión de una sola base o la extensión de cebadores específicos del alelo en una micromatriz.

El documento WO9923256 divulga un análisis en micromatriz de ADN genómico obtenido de la digestión de una endonucleasa de restricción, seguido de la unión de adaptadores y la amplificación usando cebadores complementarios a las secuencias de los adaptadores.

Syvanen et al., (Human Mutation. 1999, vol 13, Nº 1, páginas 1-10) y Zhao et al. (Nucleic Acid Res. 2001. vol 29, Nº 4, páginas 955-959) divulgan la extensión de una sola base en una micromatriz.

El documento US2002039728 divulga sustratos y formatos de matrices a base de perlas.

Dean et al. (Proc Nat Academy Sci, 2002, vol 99, Nº 8, páginas 5261-5266) y Hosono S. et al. (Genome Research, 2003, vol 13, Nº 5, páginas 954-964) divulgan la amplificación de genomas completos usando la amplificación de múltiples desplazamientos seguida del análisis de los polimorfismos de ácidos nucleicos.

La capacidad de determinar simultáneamente el genotipo de grandes números de marcadores de SNP a través de una muestra de ADN cada vez está cobrando mayor importancia para los estudios de vinculación y asociación genética. Una limitación importante para los estudios de asociación de genomas completos es la falta de una tecnología para llevar a cabo la genotificación de SNP altamente multiplexados. La generación del mapa de 65 haplotipos completo del genoma humano a través de los principales grupos étnicos proporcionará el contenido de SNP para los estudios de asociación de todo el genoma (estimado en aproximadamente 200.000-300.000 SNP) . Sin embargo, los métodos de genotipificación actualmente disponibles son tediosos y poco eficaces en la clasificación del gran número de SNP necesarios para generar un mapa de haplotipos.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de métodos para la consulta simultánea de grandes números de locus de genes a nivel del genoma completo. Tales beneficios afectarán al proceso de descubrimiento genómico y al análisis genético de enfermedades, así como al análisis genético a nivel individual. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona otras ventajas adicionales. La presente invención describe y muestra un método para llevar a cabo reacciones de multiplexación a gran escala que darán paso a una nueva era en la genómica.

Resumen de la invención En un aspecto, la presente invención presenta un método de acuerdo con la reivindicación 1. Las sondas de ácido nucleico son, como máximo, de 125 nucleótidos de longitud. Sin embargo, se pueden usar sondas que tengan cualquiera de una variedad de longitudes o secuencias como se expone en más detalle a continuación.

En otro aspecto, la presente divulgación presenta un método para la detección de locus tipificables de un genoma que incluye las etapas de proporcionar una población representativa amplificada de fragmentos de genoma que tengan tales locus tipificables; poner en contacto los fragmentos de genoma con una pluralidad de sondas de ácido nucleico que tengan secuencias correspondientes a los locus tipificables en condiciones donde se formen híbridos de sonda-fragmento; y detectar directamente locus tipificables de los híbridos de sonda-fragmento.

En un aspecto adicional, la presente divulgación presenta un método para la detección de locus tipificables de un genoma que incluye las etapas de proporcionar una población representativa amplificada de fragmentos del genoma que tienen los locus tipificables; poner en contacto los fragmentos de genoma de una pluralidad de sondas de ácido nucleico inmovilizadas que tienen secuencias correspondientes a los locus tipificables en condiciones donde se formen híbridos de sonda-fragmento inmovilizados; modificar los híbridos de sonda-fragmento inmovilizados; y detectar una sonda o un fragmento que se haya modificado, detectando de ese modo los locus tipificables del genoma.

La divulgación también proporciona un método que incluye las etapas de (a) proporcionar una pluralidad de fragmentos de genoma, donde la pluralidad de fragmentos de genoma tiene al menos 100 ug de ADN que tiene una complejidad de al menos 1 gigabase; (b) poner en contacto la pluralidad de fragmentos de genoma con una pluralidad de diferentes sondas de ácido nucleico inmovilizadas, donde al menos 500 de las diferentes sondas de ácido nucleico se hibridan con fragmentos de genoma para formar híbridos de sonda-fragmento; y (c) detectar locus tipificables de los híbridos de sonda-fragmento.

Un método de la divulgación también puede incluir las etapas de (a) proporcionar una pluralidad de fragmentos de genoma, donde la pluralidad de fragmentos de genoma tiene una concentración de al menos 1 ug/ul de ADN que tiene una complejidad de al menos 1 gigabase; (b) poner en contacto la pluralidad de fragmentos de genoma con una pluralidad de diferentes sondas de ácido nucleico inmovilizadas, donde al menos 500 de las diferentes sondas de ácido nucleico se hibridan con fragmentos de genoma para formar híbridos de sonda-fragmento; y (c) detectar locus tipificables de la los híbridos de sonda-fragmento.

En un aspecto adicional, la presente divulgación describe un método de amplificación de ADN genómico que incluye 45 las etapas de proporcionar ADN genómico de doble cadena aislado; producir ADN mellado poniendo en contacto el ADN genómico... [Seguir leyendo]

1. Un método para indicar la presencia de un polimorfismo de nucleótido único (SNP) de interés en los loci tipables de un genoma, que comprende las etapas de:

(a) amplificar representativamente un genoma nativo para obtener una población representativa de fragmentos de genoma que comprende loci tipables, teniendo cada uno una posición de interrogación que corresponde a un SNP;

(b) poner en contacto dichos fragmentos con una matriz de diferentes sondas de ácidos nucleicos inmovilizados en condiciones en las que se forman los híbridos sonda-fragmentos, donde dichos fragmentos tienen una concentración de al menos 1 μg/μl de ADN y donde dichas sondas de ácidos nucleicos inmovilizados comprenden una región que es complementaria de los loci tipables de un genoma;

(c) poner en contacto la pluralidad de sondas de ácidos nucleicos con un inhibidor de la extensión ectópica (EEI) en condiciones en que se forman híbridos de EEI de la sonda;

(d) poner en contacto dichos híbridos sonda-fragmento con una enzima de modificación, donde si la posición de interrogación de un locus tipable contiene un SNP de interés, un resto de detección se une a la sonda hibridada; y

(e) detectar la sonda, indicando de esta forma la presencia de dichos polimorfismos de nucleótidos únicos de interés en los loci tipables de dicho genoma; y donde la etapa (e) detecta los híbridos sonda-fragmento selectivamente en comparación con los híbridos sonda-EEI.

2. El método de la reivindicación 1, donde una complejidad de al menos 0, 1, 0, 2, 0, 5, 1, 2 o 3 Gigabases de una única secuencia de dicho genoma nativo está presente en dicha población de fragmentos de genoma.

3. El método de la reivindicación 1, donde dicha amplificación representativa comprende una amplificación del cebador aleatorio.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicha población representativa amplificada de fragmentos de genoma se amplifica en condiciones isotermas.

5. El método de la reivindicación 1, donde dicha población representativa de fragmentos de genoma que se pone en contacto con dicha pluralidad de diferentes sondas de ácido nucleico comprende al menos 10 μg, 50 μg, 100 μg, 150 μg, 200 μg o 300 μg de ADN.

6. El método de la reivindicación 1, donde al menos 100, 500, 1000, 5000, 10, 000, 50, 000 100, 000, 500, 000 o 106 de dichas sondas de ácidos nucleicos diferentes se hibridan con fragmentos de genoma para formar híbridos sondafragmento.

7. El método de la reivindicación 1, donde las regiones complementarias de dichas sondas tienen una longitud máxima de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, o 100 nucleótidos.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichas sondas de ácidos nucleicos inmovilizados se unen a cualquiera de partículas, el interior de una celda de flujo o un sustrato plano.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichas sondas de ácidos nucleicos inmovilizados se configuran como una matriz de matrices, que tiene una pluralidad de matrices individuales configuradas para permitir el procesamiento de múltiples muestras y/u opcionalmente donde dichas matrices individuales se configuran para disponerse en los pocillos de una placa de microvaloración, y el método comprende además disponer dichas matrices individuales en los pocillos de la placa de microvaloración.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el resto de detección es un ligando de afinidad y la etapa (e) comprende poner en contacto dichas sondas marcadas con el ligando de afinidad con un receptor y un reactivo de amplificación, donde dicho receptor tiene uno o más sitios capaces de unirse a dicho ligando, y donde dicho reactivo de amplificación tiene afinidad por dicho receptor, por lo cual se forman complejos multiméricos entre dichas sondas marcadas con el ligando de afinidad y dicho reactivo de amplificación.

11. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el EEI es una proteína de unión al ácido nucleico monocatenario (SSB) .

12. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el EEI es un oligonucleótido de bloqueo que es complementario del extremo 3’ de una sonda de ácido nucleico.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos una de la pluralidad de diferentes sondas de ácidos nucleicos comprende una primera región y una segunda región, donde la segunda región es complementaria de la primera región, por lo que una sonda que no forma un híbrido sonda-fragmento forma una estructura en horquilla que no puede añadir un nucleótido o análogo de nucleótido mediante una polimerasa.

14. El método de la reivindicación 13, donde la primera y segunda regiones de la sonda del ácido nucleico no se hibridan sustancialmente a las temperaturas utilizadas durante la hibridación sonda-fragmento, pero se hibrida para formar estructuras en horquilla a las temperaturas utilizadas durante la adición de la polimerasa.

Figura 3

Condición dNTP (mM) cebador (uM) Rendimiento (ug) Amplificación

1 1 50 49, 5 4950

2 1 10 28, 5 2850

3 1 2 12, 0 1200

4 1 0 6, 0 600

5 2 50 79, 5 7950

6 2 10 42, 0 4200

7 2 2 21, 0 2100

8 2 0 6, 0 600

Figura 12A.

Precisión de la genotipificación:

Tasa de llamada Precisión Llamada Llamadas correctas

100% 99, 95% 4092 4090

99, 70% 100% 4078 4078