Métodos para predecir los niveles de poliglutamato de metotrexato utilizando farmacogenética.

Método para determinar la eficacia de una terapia de metotrexato para un individuo que presenta una enfermedadinflamatoria o una enfermedad autoinmunológica,

comprendiendo dicho método:

determinar para el individuo a presencia o ausencia de un genotipo predictivo del nivel de poliglutamatos demetotrexato (MTXPG) en linfoblastos o eritrocitos durante dicha terapia de metotrexato, comprendiendo dichogenotipo una variación homocigótica -401 C por T en el promotor del gen γ-glutamil-hidrolasa (GGH).comprendiendo además dicho genotipo una variación homocigótica 80G por A en el gen del portador de folatoreducido (RFC-1) SLC19 A1, y

generando un índice farmacogenético para el individuo en el gen GGH y en el gen RFC-1, en el que el índicefarmacogenético es indicativo del nivel de MTXPG en el individuo.

Métodos para predecir los niveles de poliglutamato de metotrexato utilizando farmacogenética ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El folato (ácido fólico) es una vitamina que resulta esencial para los procesos de sostén de la vida, de síntesis, replicación y reparación del ADN. El folato también resulta importante para la biosíntesis de proteínas, otro proceso crucial para la viabilidad celular.El compuesto pteridina llamado metotrexato (MTX) es estructuralmente similar al folato y en consecuencia puede unirse a los sitios activos de varios enzimas que normalmente utilizan el folato como coenzima para la biosíntesis de precursores de nucleótidos purina y pirimidina del ADN y para la interconversión de aminoácidos durante la biosíntesis de proteínas. A pesar de su similitud estructural con el ácido fólico, el metotrexato no puede ser utilizado como cofactor por enzimas que requieren folato, y en su lugar compite con el cofactor folato para los sitios de unión del enzima, inhibiendo de esta manera la biosíntesis de proteínas y ADN y, por lo tanto, la división celular.

La capacidad del antagonista del folato llamado metotrexato de inhibir la división celular ha sido aprovechado en el tratamiento de algunas enfermedades y condiciones que se caracterizan por el crecimiento celular rápido o aberrante. Por ejemplo, el metotrexato es actualmente uno de los fármacos más ampliamente prescritos para el tratamiento de la artritis reumatoide, la soriasis y el cáncer (Weinblatt et al., Eng. J. Med. 312:818-822, 1985; Kremer y Lee, Arthritis Rheum. 29:822-831, 1986) . Aunque el metotrexato es de los fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad mejor tolerados, una desventaja importante de la terapia de metotrexato es una problemática variabilidad entre pacientes en la respuesta clínica y la aparición impredecible de efectos secundarios, incluyendo alteraciones gastrointestinales, alopecia, elevación de los enzimas hepáticos y supresión de la médula ósea (Weinblatt et al., Arthritis Rheum. 37:1492-1498, 1994; Walker et al., Arthritis Rheum. 36:329-335, 1993) . Varios estudios en ensayos clínicos bien controlados han demostrado que el metotrexato resulta efectivo para reducir la discapacidad funcional, produciéndose el efecto máximo tras aproximadamente seis meses de terapia. Sin embargo, resultados recientes de estudios retrospectivos en una cohorte de gran tamaño de pacientes con artritis reumatoide sugieren que la dosificación de metotrexato podría ser subóptima en algunos pacientes (Ortendahl et al., J. Rheumatol. 29:2084-2091, 2002) . De esta manera, la falta de un seguimiento eficiente del fármaco terapéutico en la terapia con metotrexato y la dificultad para individualizar rápidamente la respuesta maximizadora de la dosis de metotrexato dificulta el tratamiento efectivo del paciente.

El metotrexato entra en las células mediante el portador de folato reducido (RFC-1) , cuyo símbolo reconocido es SLC19A1, y resulta activado intracelularmente por la folilpoliglutamato sintasa formando poliglutamatos de metotrexato (MTXPG) (Chabner et al., J. Clin. Invest. 76:907-912, 1985) . La adición secuencial en enlace y de residuos de ácido glutámico incrementa la retención intracelular del metotrexato (Allegra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4881-4885, 1985) . El proceso de poliglutamación compite con la desconjugación por parte de la yglutamilhidrolasa (GGH) (Rhee et al., Mol. Pharmacol. 53:1040-1046, 1998; Yao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10134-10138, 1996; Panetta et al., Clin. Cancer Res. 8:2423-2429, 2002) , un enzima lisosómico que presenta una elevada afinidad para los poliglutamatos de cadena larga (Masson et al., J. Clin. Invest. 97: 73-80, 1996) .

La acumulación de MTXPG resulta crítica para los efectos farmacológicos del metotrexato. In vivo, la concentración de MTXPG en los linfoblastos y eritrocitos aparentemente se correlaciona con la respuesta terapéutica al metotrexato en pacientes con leucemia (Dervieux et al., Blood 100:1240-1247, 2002; Dervieux et al., Arthritis Rheum., en prensa, 2004) o con artritis reumatoide (Angelis-Stoforidis et al., Clin. Exp. Rheumatol. 17:313-320, 1999; Allegra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4881-4885, 1985) . La poliglutamación del metotrexato se cree que estimula una inhibición sostenida de la síntesis de novo de purinas por parte de la 5-aminoimidazol-carboxamida ribonucleótido transformilasa (ATIC) (Dervieux et al., Blood 100:1240-1247, 2002; Allegra et al., supra, 1985) , estimulando de esta manera la acumulación de adenosina, un potente agente antiinflamatorio (Baggott et al., Biochem. J. 236:193-200, 1986; Morabito et al., J. Clin. Invest. 101:295-300, 1998; Montesinos et al., Arthritis 48:240-247, 2003; Cronstein et al., J. Clin. Invest. 92:2675-2682, 1993) . Además, los MTXPG son inhibidores de la timidilato sintasa (TS) (Allegra et al., J. Biol. Chem. 260:9720-9726, 1985) . La TS metila el monofosfato de desoxiuridina, produciendo desoxitimidilato, proporcionando una fuente de novo única de timidilato.

Parte de la gran variabilidad entre individuos en respuesta al metotrexato se relaciona con polimorfismos comunes en genes que participan en la farmacocinética o farmacodinámica del metotrexato (Rolling y Dervieux, Nat. Rev. Cancer 1:99-108, 2001) . Recientemente, se ha identificado una transición G a A en el exón 1 (posición 80) de RFC1, que resulta en una sustitución de arginina por histidina en el codón 27 (Chango et al., Mol. Genet. Metab. 70:310315, 2000) . Sin embargo, la consecuencia funcional de este polimorfismo sobre el transporte del metotrexato sigue sin estar clara (Whetstine et al., Clin. Cancer Res. 7:3416-3422, 2001; Laverdiere et al., Blood 100:3832-3834, 2002) . Además, un estudio reciente de niños con leucemia linfoblástica aguda ha sugerido que la variante A podría estar asociada a malos resultados clínicos en comparación con los pacientes que presentan el genotipo G/G; los

individiuos que portan el genotipo A/A presentaban concentraciones plasmática más altas de metotrexato que aquellos con los genotipos G/G o G/A (Laverdiere et al., supra, 2002) .

Debido a que las diferencias individuales en los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos pueden resultar difíciles de predecir y debido a que el genotipo del paciente afecta a estos parámetros, podría incrementarse la seguridad y efectividad del tratamiento con metotrexato mediante el genotipado del paciente. De esta manera, existe una necesidad de nuevas correlaciones entre genotipos del paciente y eficacia de la terapia de metotrexato. También existe una necesidad de nuevos métodos para determinar u optimizar la eficacia de la terapia de metotrexato mediante la determinación de los niveles de MTXPG en un paciente mediante genotipado. La presente invención satisface estas necesidades y también proporciona ventajas relacionadas.

BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos para determinar la eficacia de la terapia con MTX en un individuo sometido a terapia según se define en la reivindicación 1.

El método predice el nivel de poliglutamatos de metotrexato (MTXPG) en un individuo sometido a terapia de metotrexato.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra las estructuras del metotrexato y de los poliglutamatos de metotrexato. Figura 1A: estructura química del metotrexato. Figura 1B: estructura química de los poliglutamatos de metotrexato, en la que N se refiere al número de glutamatos unidos al metotrexato.

La figura 2 muestra un gráfico de dispersión de las concentraciones predichas versus observadas de MTXPG. Se predijeron las concentraciones de MTXPG utilizando un análisis de regresión lineal multivariante que incluía edad, vía de administración, dosis semanal de MTX y genotipos RFC-1 y GGH según la ecuación multivariante de la Tabla 2. Figura 2A: gráfico de dispersión de concentraciones predichas versus observadas de MTXPG1-5. Figura 2B: gráfico de dispersión de concentraciones predichas versus observadas de MTXPG3-5.

La figura 3 muestra el efecto del índice farmacogenético (IF) sobre las concentraciones de MTXPG. Se calculó el IF como la presencia del genotipo RFC-1 180A/A menos la presencia del genotipo GGH-401T/T (ver el Ejemplo 1) . Figura 3A: Se asoció un IF incrementado, por ejemplo de -1 a 1, a niveles más altos de MTXPG1-5 (p=0, 057) y a niveles más altos de MTXPG3-5 (p=0, 027) . Figura 3B: Un IF incrementado, por ejemplo de -1 a 1, se asoció a niveles más altos de MTXPG5 (p=0, 0006) y a niveles más altos de MTXPG4 (p=0, 027) .

La figura 4 muestra el efecto del índice farmacogenético (IF) sobre la probabilidad de un individuo de presentar niveles de MTXPG3-5 superiores a la... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar la eficacia de una terapia de metotrexato para un individuo que presenta una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunológica, comprendiendo dicho método: determinar para el individuo la presencia o ausencia de un genotipo predictivo del nivel de poliglutamatos de metotrexato (MTXPG) en linfoblastos o eritrocitos durante dicha terapia de metotrexato, comprendiendo dicho genotipo una variación homocigótica -401 C por T en el promotor del gen y-glutamil-hidrolasa (GGH) . comprendiendo además dicho genotipo una variación homocigótica 80G por A en el gen del portador de folato reducido (RFC-1) SLC19 A1, y generando un índice farmacogenético para el individuo en el gen GGH y en el gen RFC-1, en el que el índice farmacogenético es indicativo del nivel de MTXPG en el individuo.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el índice farmacogenético se calcula como la suma o la diferencia entre el número de alelos variantes homocigóticos en el promotor del gen GGH y el gen RFC-1.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la generación del índice farmacogenético comprende asignar a cada uno del gen RFC-1 y el gen GGH, (a) un primer valor en el caso de que el individuo sea de tipo salvaje o heterocigótico para la variación, o (b) un segundo valor en el caso de que el individuo sea homocigótico para la variación, y calcular el índice farmacogenético a partir del primer y el segundo valores.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el cálculo comprende restar el valor asignado al gen GGH del valor asignado al gen RFC-1.

5. Método según la reivindicación 1, en el que se determina la eficacia mediante el cálculo de un nivel de MTXPG utilizando el análisis de regresión lineal multivariante.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el nivel de MTXPG comprende MTXPG1-5 ó MTXPG3-5.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el nivel de MTXPG1-5 se determina basándose en dicho genotipo y por lo menos otro factor seleccionado de entre el grupo que consiste de las dosis de metotrexato obtenidas de dicho individuo, la vía de administración de dichas dosis de metotrexato y la edad de dicho individuo.

8. Método según la reivindicación 6, en el que el nivel de MTXPG3-5 se determina basándose en dicho genotipo y por lo menos otro factor seleccionado de entre el grupo que consiste de las dosis de metotrexato obtenidas de dicho individuo, la vía de administración de dichas dosis de metotrexato y la edad de dicho individuo.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho individuo presenta artritis reumatoide.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho individuo presenta lupus eritematoso sistémico.

11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el que dicha terapia de metotrexato es terapia de dosis baja de metotrexato.

12. Método según la reivindicación 1, en el que dicho genotipo se determina con una muestra de ácidos nucleicos obtenida a partir de sangre completa.

13.Método según la reivindicación 1, en el que dicho genotipo se determina mediante un método que comprende PCR, secuenciación de ácidos nucleicos, polimorfismo de longitudes de fragmentos de restricción (PLFR) , ensayo de movilidad de heterodúplex (EMH) o electroforesis en gradiente de gel desnaturalizante (EGGD) .

14.Método según la reivindicación 11, que comprende además determinar una dosis efectiva de terapia de metotrexato para dicho individuo.