Métodos in vitro para la inducción y el mantenimiento de líneas celulares vegetales como células en suspensión únicas con paredes celulares intactas, y su transformación.

Método para producir una célula vegetal única, aislada, que comprende una pared celular intacta,

en el que dichométodo comprende el cultivo de células vegetales que comprenden las paredes celulares intactas en un medio quecontiene glicerol y un compuesto despolimerizador de tubulina seleccionado de entre el grupo constituido por lasdinitroanilinas y un compuesto de conformidad con la fórmula siguiente:

en la que

X ≥ CO2R, CH2CO2R, CH2CH2CO2R, (CH2)3CO2R, OCH2CO2R, OCH(CH3)CO2R, OC(CH3)2CO2R,

CH2OCH2CO2R, CH2CH(CO2CH2CH3)CO2R, o OCH(CO2CH2CH3)CO2R

Y ≥ CN, Cl, Br, F, o NO2

Ar1 ≥ fenilo no sustituido, piridina no sustituida, fenilo 1-3 sustituido, piridina 1-3 sustituida, o sustituida conhalógeno o CN

Ar2 ≥ fenilo no sustituido, piridina no sustituida, fenilo 1-3 sustituido, piridina 1-3 sustituida, o sustituida conhalógeno o CN;

y

R ≥ H o éster lineal o ramificado con 1-5 carbonos

Métodos in vitro para la inducción y el mantenimiento de líneas celulares vegetales como células en suspensión únicas con paredes celulares intactas, y su transformación.

Campo de la invención La invención pertenece en parte al ámbito de la propagación de líneas celulares vegetales, incluyendo los métodos para la propagación de células vegetales en suspensiones en forma de células únicas

Antecedentes de la invención Durante las últimas dos décadas, las técnicas de ingeniería genética vegetal han experimentado grandes avances acompañados de grandes mejoras en el desarrollo de los procesos de cultivo de células vegetales a gran escala para la producción de metabolitos secundarios útiles. Desde 1995 (Moffat, 1995; Ma et al., 2003) , estos cultivos de células vegetales en suspensión se han utilizado de manera creciente como valiosos sistemas de células hospedadoras para la expresión de proteínas recombinantes.

Las suspensiones o los callos inducidos por auxinas, pese a tener su origen en un único tejido, suelen contener células con diversos fenotipos. Por ese motivo, las líneas transgénicas elaboradas a partir de tales tipos de células acostumbran a ser muy heterogéneas y a presentar niveles de expresión irregulares. Ello ha hecho necesaria la obtención de clones productores de multitud de metabolitos secundarios útiles a partir de un único protoplasto, como por ejemplo un clon celular productor de shikonina en grandes cantidades, preparado a partir de protoplastos de Lithospermum er y throrhizon (Maeda et al., 1983) .

Hasta ahora era preciso formar protoplastos para disgregar las células, no sólo con el fin de seleccionarlas sino también para posibilitar la transformación por electroporación/PEG de las células vegetales cultivadas. La preparación de los protoplastos ha sido necesaria para el aislamiento de clones celulares individuales a partir de tejidos vegetales. Sin embargo, en general resulta difícil que los protoplastos regeneren sus paredes con normalidad, puesto que los protoplastos aislados suelen permanecer en latencia y no son proclives a dividirse (Hahne and Hoffmann, 1984) . En muchos estudios efectuados con protoplastos cultivados, el primer y más importante polisacárido generado es la callosa, compuesto de 1, 3-, 8-glucopiranosas (Klein et al., 1981) .

Las plantas dañadas o estresadas segregan a menudo grandes cantidades de dicho glucano a los espacios periplásmicos (Currier, 1957) . Durante las primeras etapas de la regeneración de la pared, la unión entre la celulosa y el xiloglucano no es tan fuerte como en las plantas intactas (Hayashi et al., 1986) . Dado que la organización macromolecular del xiloglucano y de la celulosa en las paredes celulares primarias parece ser la responsable de la resistencia y la extensibilidad (Hayashi and Maclachlan, 1984) , la acumulación de xiloglucano y celulosa alrededor de los protoplastos parece ser esencial para su división y potencial de crecimiento. Este prerrequisito frena la división del protoplasto, dilatando el tiempo que éste necesita para regenerarse en una célula normal, dotada de las características celulares de las líneas parentales.

Por lo tanto, uno de los desafíos técnicos en el campo de los cultivos de células vegetales estriba en aislar células viables únicas, susceptibles de ser clonadas a partir de tejidos vegetales cultivados (Bourgin, 1983; Tabata et al., 1976) . Los cultivos en suspensión siempre generan agregados heterogéneos de células, constituidos por hasta varios centenares de células. Nada se sabe sobre lo que mantiene unidas a las células agregadas y no existen publicaciones que señalen una única enzima que pueda disociar los agregados y mantenerlos en forma de células únicas con la pared celular intacta en condiciones in vitro.

Diversos artículos apuntan a la pectina como parte implicada en las propiedades adhesivas de la célula, pero dicho vínculo se ha propuesto en tiempos relativamente recientes (Bouton et al., 2002) . Además, se han descrito fuertes reducciones de las propiedades adhesivas celulares (Sterling et al., 2006) .

Los mutantes qual-1 presentan células radiculares desprendidas y únicas (Bouton et al., 2002) . El menor contenido de pectina ha sido corroborado por experimentos de inmunofluorescencia con anticuerpos dirigidos contra epítopos específicos de la pectina. Tales observaciones apuntan a que la enzima codificada puede estar implicada en la síntesis de polisacáridos pécticos e indica claramente que la pectina desempeña un cometido en las propiedades adhesivas de las células vegetales.

Así pues, la alteración de la síntesis de pectina con el fin de eliminar las propiedades adhesivas celulares puede facilitar la separación de las células. En cultivos en suspensión de Taxus se ha descrito el aislamiento de células únicas tras un solo tratamiento a base de enzimas degradadoras de pectina aplicado con ese propósito (Naill, 2005) . Tales células únicas de Taxus fueron seleccionadas para obtener líneas clonales de élite productoras de niveles elevados de taxol. Sin embargo, dicho método no resulta útil para el mantenimiento de células únicas en suspensión con la presencia continua de enzima en el medio. Por su parte, el rendimiento máximo de células únicas obtenido con un tratamiento a base de breves pulsos de enzimas o combinaciones de enzimas fue sólo del 17, 1% al 34, 4% (Naill, 2005) . El tratamiento continuo de suspensiones de arroz con pectinasa sólo ha dado como fruto pequeños agregados en suspensión a concentraciones del 0, 005%, sin que la suspensión pudiera mantenerse en forma de células únicas (Lee et al., 2004) . Los tratamientos prolongados con la combinación de enzimas formada por pectinasa y celulasa durante más de 8 horas han acabado provocando la lisis de las células (Naill, 2005) .

En cambio, se ha descrito que la separación de las células en cultivos en suspensión de soja mejora con la presencia de colquicina (Umetsu et al., 1975) . Para la separación de células, este alcaloide se añade al medio de cultivo en concentraciones más bajas (0, 1-1, 0 mM) que las empleadas (5-20 mM) para la inducción de la poliploidía cromosómica. Sin embargo, la colquicina inhibe la mitosis tanto en las células vegetales como animales (Lewin, 1980) , dado que se une a la tubulina e impide el ensamblaje de los microtúbulos. De ahí que para conseguir la separación de las células, la concentración de colquicina y el tiempo de tratamiento deban ser lo más bajos y breves posible.

Los alcaloides derivados de la colquicina han sido utilizados para la sincronización del crecimiento en cultivos de células animales, finalidad para la que normalmente se añaden en una concentración de 0, 5 mM, resultando las células detenidas en pocas horas, antes de la mitosis. Aunque el efecto morfogénico es bastante similar al de las células animales, las células vegetales pueden seguir dividiéndose en presencia de colquicina 0, 1 mM (Umetsu et al., 1975) . La viabilidad de células de soja disminuyó después de 4 días de cultivo en suspensión con colquicina 1 mM. Además, sólo el 44, 8% de las células resultaron viables con tales tratamientos, pero a diferencia de lo que sucede con las células animales, pudieron mantenerse en división.

Se ha investigado la utilización de inhibidores de la despolimerización de tubulina y de las oligosacarinas para el mantenimiento de suspensiones de células únicas en cultivos vegetales in vitro. La bibliografía ofrece cierta información que se remonta hasta 1975 referente a la utilización de colquicinas para la separación de células; véase el apartado de Referencias bibliográficas. También se ha investigado la utilización de los inhibidores de la tubulina como herbicidas.

La producción y la recuperación de eventos transgénicos de élite dependen en gran medida del desarrollo de tecnologías factibles. Los métodos actuales para la transformación de agregados de células en suspensión se basan en Agrobacterium y fibras. El método basado en Agrobacterium presenta una tasa de integración de fragmentos superfluos del vector de hasta el 67-90%, lo que lo convierte en un proceso muy ineficiente, mientras que la transformación con WHISKERS™ no sirve como proceso de alto rendimiento (HTP) . El método basado en el uso del PEG se utiliza siempre con protoplastos, pero aunque en el caso de los protoplastos de tabaco se ha demostrado su fácil transformación, no resulta fácil convertirlo en un proceso de transformación de alto rendimiento por los problemas de regeneración de la pared celular.

La técnica parece no pronunciarse en lo referente a protocolos destinados a la transformación de células únicas cultivadas en suspensión.... [Seguir leyendo]

1. Método para producir una célula vegetal única, aislada, que comprende una pared celular intacta, en el que dicho método comprende el cultivo de células vegetales que comprenden las paredes celulares intactas en un medio que contiene glicerol y un compuesto despolimerizador de tubulina seleccionado de entre el grupo constituido por las dinitroanilinas y un compuesto de conformidad con la fórmula siguiente:

en la que 10 X = CO2R, CH2CO2R, CH2CH2CO2R, (CH2) 3CO2R, OCH2CO2R, OCH (CH3) CO2R, OC (CH3) 2CO2R, CH2OCH2CO2R, CH2CH (CO2CH2CH3) CO2R, o OCH (CO2CH2CH3) CO2R ̘#2; #2; ; = CN, Cl, Br, F, o NO2 15 Ar1 = fenilo no sustituido, piridina no sustituida, fenilo 1-3 sustituido, piridina 1-3 sustituida, o sustituida con halógeno o CN ̘#2;

Ar2 = fenilo no sustituido, piridina no sustituida, fenilo 1-3 sustituido, piridina 1-3 sustituida, o sustituida con 20 halógeno o CN;

y ̘#2;

R = H o éster lineal o ramificado con 1-5 carbonos 25

2. Método según la reivindicación 1, en el que el compuesto de la fórmula según la reivindicación 1 es el éster etílico del ácido (4-cloro-1, 5-difenil-1H-pirazol-3-iloxi) -acético.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el compuesto de la fórmula según la reivindicación 1 es 30

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho medio es un medio líquido y dichas células están en una suspensión. 35

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicho medio contiene colquicina además de un compuesto de la fórmula según la reivindicación 1.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula única, aislada, es seleccionada de entre el grupo

constituido por una célula de alga, una célula de dicotiledónea, una célula de monocotiledónea, una célula de planta vascular inferior, o una célula de planta no vascular.

7. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula aislada es transformada posteriormente con un polinucleótido heterólogo, y la célula transformada es seleccionada. 45

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha etapa de selección utiliza una selección sin marcadores.

9. Método según la reivindicación 7, en el que dicha célula transformada es transgénica o transplastómica.

10. Método según la reivindicación 7, en el que dicha etapa de transformación se lleva a cabo utilizando un método seleccionado de entre el grupo constituido por polietilenglicol, electroporación, biolística y nanopartículas.

11. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método es un método de tratamiento de alto rendimiento.

12. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula única, aislada, es seleccionada de entre el grupo constituido por una célula de tabaco, una célula de zanahoria, una célula de maíz, o una célula de estramonio.

13. Método según la reivindicación 1, en el que dicho medio es seleccionado de entre el grupo constituido por un medio de gel y semisólido.