Métodos de diagnóstico de la fibrosis hepática.

Método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo,

que comprende lasetapas de:

(a) detectar macroglobulina-α2 en una muestra de dicho individuo,

(b) detectar ácido hialurónico (AH) en una muestra de dicho individuo,

(c) detectar inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1) en una muestra de dicho individuo, y

(d) diagnosticar la presencia o severidad de la fibrosis hepática en dicho individuo basándose en la presencia onivel de MG-α2, AH y TIMP-1.

Métodos de diagnóstico de la fibrosis hepática

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere de manera general a los campos de la hepatología y la fibrosis y, más concretamente, a un panel de marcadores serológicos que conjuntamente son diagnósticos de la fibrosis hepática.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

La fibrosis progresiva del hígado, riñones, pulmones y otros órganos frecuentemente resulta en el fallo orgánico, que conduce al trasplante de órgano o a la muerte y afecta a millones de personas en los Estados Unidos y en todo el mundo. La fibrosis hepática, por ejemplo, es la causa gastrointestinal no maligna más importante de muerte en los Estados Unidos, y la progresión de la fibrosis es el determinante principal de morbilidad y mortalidad en pacientes con enfermedad hepática crónica. Además, el proceso de la fibrosis es común a enfermedades hepáticas de muchas etiologías, incluyendo la hepatitis B y C vírica crónica, enfermedades hepáticas autoinmunológicas tales como la hepatitis autoinmunológica, la enfermedad hepática alcohólica, la enfermedad hepática grasa, la cirrosis biliar primaria y la enfermedad hepática inducida por medicamentos. La fibrosis observada en estos trastornos resulta de insultos crónicos al hígado, tales como la infección vírica, el alcohol o fármacos.

La hepatitis C, por ejemplo, es una de las causas principales de enfermedad hepática crónica en los Estados Unidos, en donde se estima que 3, 9 millones de personas se encuentran infectadas crónicamente por virus de la hepatitis C (VHC) y aparecen aproximadamente 30.000 nuevos casos de VHC aguda cada año (Alter, Semin. Liver Dis. 15:5-14, 1995) . La prevalencia de la hepatitis C se estima en 1, 8% en los Estados Unidos, con hasta 10.000 muertes al año, resultando probablemente de la infección crónica de hepatitis C (Alter, supra, 1995) .

Aunque la fibrosis hepática es un proceso reversible que resulta en la acumulación de matriz extracelular, la cirrosis hepática es un proceso irreversible caracterizado por bandas gruesas de matriz que circundan por completo el parénquima formando nódulos. Si no se trata, la fibrosis del hígado conduce a cirrosis y finalmente a enfermedad hepática de estadio terminal o a cáncer. La cirrosis del hígado es una condición común que con frecuencia no se llega a detectar. Por ejemplo, en una muestra de gran tamaño de la población danesa general, la prevalencia de cirrosis hepática era de 4, 5%, de entre los que un tercio no habían sido diagnosticados en el momento de la muerte (Graudal, J. Intern. Med. 230:165-171, 1991) .

El diagnóstico oportuno y exacto de la fibrosis hepática resulta importante para el tratamiento médico eficaz. A título de ejemplo, los pacientes con hepatitis C y cirrosis es menos probable que respondan al tratamiento con interferón-a que los pacientes con una enfermedad menos avanzada (Davis, Hepatology 26 (supl. 1) :122-127S) . De manera similar, los tratamientos para la infección crónica por VHC pueden estar contraindicados en pacientes con enfermedad histológicamente avanzada y descompensada (NIH Consensus Development Conference Panel Statement, Hepatology 26 (supl. 1) :25-105S, 1997) . La importancia del diagnóstico precoz queda adicionalmente enfatizada por complicaciones tempranas graves tales como la ruptura de varices asociadas a la cirrosis; estas complicaciones pueden evitarse mediante una detección precoz de la cirrosis (Calés y Pasqual, Gastroenterol. Clin. Biol. 12:245-254, 1988) .

El diagnóstico de la presencia o severidad de la enfermedad hepática fibrótica resulta difícil, siendo la biopsia hepática el método actualmente más fiable del que se dispone. Desafortunadamente, la biopsia hepática presenta varias limitaciones: dolor en aproximadamente 30% de los pacientes; riesgo de complicaciones severas, tales como hemorragias o infección; una tasa de muerte de 3 en 10.000, y el coste de la hospitalización (Nord, Gastrointest. Endosc. 28:102-104, 1982; Cadranel et al., Hepatology 32:47-481, 2000, y Poynard et al., Can. J. Gastroenterol. 14:543-548, 2000) . Además, algunas enfermedades de progresión lenta tales como la hepatitis C requieren biopsias repetidas para una evaluación continua de la progresión de la enfermedad, incrementando de esta manera los riesgos y costes del procedimiento. Finalmente, la biopsia puede no detectar la enfermedad debido a la distribución heterogénea de los cambios patológicos en el hígado; por lo tanto, no resulta inesperado que se observen falsos negativos en un porcentaje significativo de casos biopsiados (Nord, supra, 1982) .

Durante años se han buscado marcadores bioquímicos o serológicos que reflejen los procesos fibróticos de la enfermedad hepática y que puedan servir como sustituto de la biopsia hepática. Sin embargo, el rendimiento de cualquier marcador por sí solo no ha sido suficientemente bueno para sustituir el procedimiento de la biopsia en la detección o estadificación de la fibrosis. De esta manera, existe una necesidad de un método no invasivo de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática. La presente invención satisface dicha necesidad al

proporcionar un método conveniente y fiable para la detección de fibrosis hepática que resulta adecuado para los ensayos en serie. Se proporcionan asimismos ventajas relacionadas.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante la detección de la macroglobulina-a2 (MG-a2) en una muestra del individuo; la detección de ácido hialurónico (AH) en una muestra procedente del individuo; la detección de inhibidor de metaloproteinasa-1 en tejidos (TIMP-1) en una muestra del individuo, y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basado en la presencia o nivel de MG-a2, AH y TIMP-1. Un método de la invención puede resultar útil, por ejemplo, para diferenciar una fibrosis hepática leve o la inexistencia de la misma (F0-F1) , de la fibrosis hepática moderada a severa (F2-F4) .

Los métodos de la invención para el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática pueden resultar útiles en una diversidad de poblaciones de pacientes, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, aquéllas con hepatitis vírica, enfermedades hepáticas autoinmunológicas tales como la hepatitis autoinmunológica, la enfermedad hepática alcohólica, la enfermedad hepática grasa y la enfermedad hepática inducida por medicamentos. En una realización, se utiliza un método de la invención para diagnosticar la presencia o la severidad de la fibrosis hepática en un individuo infectado por virus de la hepatitis C.

Puede resultar útil una diversidad de medios para detectar a2-MG, AH y TIMP-1 en una muestra. En una realización, la invención se pone en práctica mediante la determinación del nivel de proteína MG-a2 en una muestra del individuo que debe diagnosticarse, utilizando, por ejemplo, uno o más de los agentes de unión específicos de MGa2, tales como anticuerpos anti-MG-a2. En otra realización, se pone en práctica un método de la invención mediante la determinación del nivel de actividad de MG-a2 en una muestra del individuo.

También puede utilizarse una diversidad de medios en un método de la invención con el fin de detectar ácido hialurónico en una muestra. En una realización, la invención se pone en práctica mediante la determinación del nivel de AH en una muestra, por ejemplo utilizando uno o más agentes de unión específicos de AH, tales como proteínas de unión a AH (PUAH) o anticuerpos anti-AH.

De manera similar, también puede utilizarse una diversidad de medios en un método de la invención con el fin de detectar TMP-1 en una muestra. En una realización, la invención se pone en práctica mediante la determinación del nivel de proteína TIMP-1 en una muestra del individuo que debe diagnosticarse. El nivel de proteína TIMP-1 puede determinarse, por ejemplo, utilizando uno o más agentes específicos de TIMP-1, tales como anticuerpos anti-TIMP

1. En otra realización, la invención se pone en práctica mediante el ensayo de la actividad de TIMP-1 en una muestra del individuo que debe diagnosticarse.

La invención proporciona, por ejemplo, un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante la determinación del nivel de proteína MG-a2 en una muestra del individuo; la determinación del nivel de AH en una muestra del individuo, y la determinación del nivel de proteína TIMP-1 en una muestra del individuo y el diagnóstico de la presencia... [Seguir leyendo]

1. Método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo, que comprende las etapas de:

(a) detectar macroglobulina-a2 en una muestra de dicho individuo,

(b) detectar ácido hialurónico (AH) en una muestra de dicho individuo,

(c) detectar inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1) en una muestra de dicho individuo, y

(d) diagnosticar la presencia o severidad de la fibrosis hepática en dicho individuo basándose en la presencia o 10 nivel de MG-a2, AH y TIMP-1.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende detectar como máximo tres marcadores de fibrosis.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende además detectar en una muestra de dicho individuo por lo

menos un marcador seleccionado de entre el grupo que consiste de: PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-º1, IL-10, apoA1, apoA2 y apoB.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho marcador es YKL-40.

5. Método según la reivindicación 1, que comprende además detectar en una muestra de dicho individuo dos o más marcadores seleccionados de entre el grupo que consiste de PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-º1, IL-10, apoA1, apoA2 y apoB.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta hepatitis vírica.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicho individuo se encuentra infectado por virus de la hepatitis C.

8. Método según la reivindicación 6, en el que dicho individuo se encuentra infectado por virus de la hepatitis B.

9. Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta una enfermedad hepática autoinmunológica.

10. Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta una enfermedad hepática alcohólica.

11. Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta una enfermedad hepática grasa.

12. Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta una enfermedad hepática inducida por medicamentos.

13. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende determinar el nivel de proteína MG-a2 en dicha muestra.

14. Método según la reivindicación 13, en el que el nivel de proteína MG-a2 se determina utilizando uno o más 45 agentes de unión específicos de MG-a2.

15. Método según la reivindicación 14, en el que el nivel de proteína MG-a2 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-MG-a2.

16. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende determinar el nivel de actividad de MG-a2.

17. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende determinar el nivel de AH en dicha muestra.

18. Método según la reivindicación 17, en el que el nivel de AH se determina utilizando uno o más agentes de unión 55 específicos de AH.

19. Método según la reivindicación 18, en el que el nivel de AH se determina utilizando uno o más agentes de unión a AH.

20. Método según la reivindicación 18, en el que el nivel de AH se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-AH.

21. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende determinar el nivel de proteína TIMP-1 en dicha muestra.

22. Método según la reivindicación 21, en el que el nivel de proteína TIMP-1 se determina utilizando uno o más agentes de unión específicos de TIMP-1.

23. Método según la reivindicación 22, en el que el nivel de proteína TIMP-1 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-TIMP-1.

24. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende determinar el nivel de actividad de TIMP-1.

25. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende determinar el nivel de proteína MG-a2, en el que la etapa (b) comprende determinar el nivel de AH, y en el que la etapa (c) comprende determinar el nivel de proteína TIMP-1.

26. Método según la reivindicación 25, en el que el nivel de cada uno de proteína MG-a2, AH y proteína TIMP-1 se determina utilizando un ensayo ligado a enzima.

27. Método según la reivindicación 1, en el que se obtiene una sola muestra de dicho individuo.

28. Método según la reivindicación 27, en el que dicha muestra se selecciona de entre el grupo que consiste de sangre, suero, plasma, orina, saliva y tejido hepático.

29. Método según la reivindicación 28, en el que dicha muestra es una muestra de suero.

30. Método según la reivindicación 1, que comprende diferenciar la fibrosis hepática leve o la ausencia de fibrosis de la fibrosis hepática moderada a severa.

31. Método de diferenciación de la fibrosis hepática leve o la ausencia de fibrosis de la fibrosis hepática moderada a severa en un individuo, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una dilución apropiada de una muestra de dicho individuo con anticuerpo anti-MG-a2 bajo condiciones adecuadas para formar un primer complejo de MG-a2 y anticuerpo anti-MG-a2,

(b) lavar dicho primer complejo para eliminar las moléculas no unidas,

(c) determinar la cantidad de primer complejo que contiene MG-a2,

(d) poner en contacto una dilución apropiada de una muestra de dicho individuo con una proteína de unión a AH (PUAH) bajo condiciones adecuadas para formar un segundo complejo de AH y PUAH,

(e) lavar dicho segundo complejo para eliminar las moléculas no unidas,

(f) determinar la cantidad de segundo complejo que contiene AH,

(g) poner en contacto una dilución apropiada de una muestra de dicho individuo con anticuerpo anti-TIMP-1 bajo condiciones adecuadas para formar un tercer complejo de TIMP-1 y anticuerpo anti-TIMP-1,

(h) lavar dicho tercer complejo para eliminar las moléculas no unidas,

(i) determinar la cantidad de tercer complejo que contiene TIMP-1, y

(j) diferenciar la fibrosis hepática leve/ausencia de fibrosis de la fibrosis hepática moderada/severa en dicho individuo basándose en las cantidades de complejos que contienen MG-a2, AH y TIMP-1.

32. Método de seguimiento de la eficacia de la terapia antifibrótica en un paciente, que comprende las etapas de:

(a) detectar macroglobulina-a2 en una muestra de un paciente en el que se ha administrado una terapia antifibrótica,

(b) detectar ácido hialurónico (AH) en una muestra de dicho paciente,

(c) detectar inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1) en una muestra de dicho paciente, y

(d) determinar la presencia o severidad de la fibrosis hepática en dicho paciente basándose en la presencia o nivel de MG-a2, AH y TIMP-1, realizando un seguimiento de esta manera de la eficacia de la terapia antifibrótica.

33. Método según la reivindicación 32, que comprende además comparar la presencia o la severidad de la fibrosis hepática determinada en la etapa

(d) con la presencia o severidad de la fibrosis hepática en dicho paciente en un tiempo anterior.

34. Método según la reivindicación 32, que comprende detectar como máximo tres marcadores de fibrosis.

35. Método según la reivindicación 32, que comprende además detectar en una muestra de dicho paciente por lo menos un marcador seleccionado de entre el grupo que consiste de: PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-º1, IL-10, apoA1, apoA2 y apoB.

36. Método según la reivindicación 32, en el que la etapa (a) comprende determinar el nivel de proteína MG-a2 en dicha muestra.

37. Método según la reivindicación 36, en el que el nivel de proteína MG-a2 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-MG-a2.

38. Método según la reivindicación 32, en el que la etapa (b) comprende determinar el nivel de AH en dicha muestra.

39. Método según la reivindicación 38, en el que el nivel de AH se determina utilizando uno o más agentes de unión a AH.

40. Método según la reivindicación 32, en el que la etapa (c) comprende determinar el nivel de proteína TIMP-1 en dicha muestra.

41. Método según la reivindicación 40, en el que el nivel de proteína TIMP-1 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-TIMP-1.

42. Método de diferenciación de la fibrosis hepática leve o ausencia de fibrosis de la fibrosis hepática 20 moderada/severa en un individuo, que comprende las etapas de:

(a) determinar un nivel de MG-a2 en una muestra de dicho individuo, (b) determinar un nivel de AH en una muestra de dicho individuo,

(c) determinar un nivel de TIMP-1 en una muestra de dicho individuo, y

(d) diagnosticar que dicho individuo presenta fibrosis hepática leve/ausencia de fibrosis en el caso de que dicho nivel de MG-a2 es inferior a un valor de corte de MG-a2 X1, dicho nivel de AH es inferior al valor de corte de AH Y1 ó dicho nivel de TIMP-1 es inferior al valor de corte Z1 de TIMP-1,

diagnosticar que dicho individuo presenta fibrosis hepática leve/ausencia de fibrosis en el caso de que dicho nivel de MG-a2 es superior a un valor de corte de MG-a2 X2, dicho nivel de AH es superior al valor de corte de AH Y2 y dicho nivel de TIMP-1 es superior al valor de corte Z2 de TIMP-1, y diagnosticar los individuos restantes como de estatus indeterminado.

43. Método según la reivindicación 42, en el que dicho individuo presenta un trastorno seleccionado de entre el

grupo que consiste de hepatitis vírica, enfermedad hepática autoinmunológica, enfermedad hepática alcohólica, enfermedad hepática grasa y enfermedad hepática inducida por medicamentos.

44. Método según la reivindicación 43, en el que dicho individuo se encuentra infectado por virus de la hepatitis C.

45. Método según la reivindicación 42, en el que dichas muestras se seleccionan de entre el grupo que consiste de sangre, suero, plasma, orina, saliva y tejido hepático.

46. Método según la reivindicación 45, en el que se determinan en una muestra de suero cada uno de dichos niveles de MG-a2, de AH y de TIMP-1.

47. Método según la reivindicación 46, en el que X1 es un valor entre 1, 8 y 2, 2 mg/ml, en el que Y1 es un valor entre 31 y 39 ng/ml, en el que Z1 es un valor entre 900 y 1.100 ng/ml,

en el que X2 es un valor entre 1, 8 y 2, 2 mg/ml, en el que Y2 es un valor entre 54 y 66 ng/ml, y en el que Z2 es un valor entre 1.415 y 1.735 ng/ml.

48. Método según la reivindicación 47,

en el que X1=2, 0 mg/ml, en el que Y1=35 ng/ml, en el que Z1=1.000 ng/ml, en el que Y2=60 ng/ml, y en el que Z2=1.575 ng/ml.

49. Método según la reivindicación 47, en el que X1=2, 0 mg/ml, en el que Y1=37 ng/ml,

en el que Z1=1.100 ng/ml, en el que X2=2, 0 mg/ml, en el que Y2=60 ng/ml, y en el que Z2=1.575 ng/ml.

50. Método según la reivindicación 42, en el que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 30%, por lo menos 65% de los individuos en dicha población son diagnosticados con fibrosis leve/ausencia de fibrosis o fibrosis moderada/severa con una precisión de por lo menos 80%.

51. Método según la reivindicación 42, en el que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 30%, por lo menos 65% de los individuos en dicha población son diagnosticados con fibrosis leve/ausencia de fibrosis o fibrosis moderada/severa con una precisión de por lo menos 90%.

52. Método según la reivindicación 42, en el que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 30%, por lo menos 65% de los individuos en dicha población son diagnosticados con fibrosis leve/ausencia de fibrosis o fibrosis moderada/severa con un valor predictivo positivo de por lo menos 90% y un valor predictivo negativo de por lo menos 90%.

53. Método según la reivindicación 42, en el que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 10%, por lo menos 70% de los individuos en dicha población son diagnosticados con fibrosis leve/ausencia de fibrosis o fibrosis moderada/severa con una precisión de por lo menos 90%.