Método y dispositivo para el diagnóstico prenatal no invasivo.

Método para el diagnóstico prenatal no invasivo que comprende las siguientes etapas de:

a. obtener una muestra de un fluido orgánico que tiene una alta probabilidad de contener células nucleadasfetales de una mujer embarazada;

b. enriquecer dicha muestra de fluido orgánico en al menos una población de células que comprende almenos un tipo de células nucleadas fetales;

c. aislar al menos una célula de entre dicho al menos un tipo de células nucleadas fetales;

d. realizar un análisis genético con dicha al menos una célula aislada de entre dicho al menos un tipo decélulas nucleadas fetales con el fin de poner de manifiesto al menos una característica genética de dicha almenos una célula nucleada fetal adecuada para permitir dicho diagnóstico;

caracterizado porque

i) el método comprende una fase de marcaje de las células fetales con un anticuerpo específico para lascélulas fetales adecuado para discriminarlas de las maternales; y

ii) dicha etapa de aislar al menos una célula de entre dicho al menos un tipo de células nucleadas fetales serealiza seleccionando individualmente células únicas en un dispositivo microfluídico diseñado para dicho fin;

y

iii) dicha etapa de aislar al menos una célula fetal se realiza seleccionando individualmente células únicaspresentes en dicho dispositivo microfluídico, marcadas previamente con dicho anticuerpo específico.

Método y dispositivo para el diagnóstico prenatal no invasivo

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para el diagnóstico prenatal no invasivo, en particular para la 5 identificación de trastornos genéticos y cromosómicos en el feto.

Estado de la técnica

El diagnóstico prenatal para trastornos cromosómicos se introdujo con el objetivo de poner de manifiesto anomalías de los cromosomas en el feto.

Hasta ahora, la certidumbre de diagnóstico de un feto que está afectado por un trastorno cromosómico puede obtenerse sólo por medio de pruebas de diagnóstico invasivas, que examinan las células embrionarias con el fin de determinar el cariotipo por medio de amniocentesis, toma de muestras de las vellosidades coriónicas o cordocentesis.

Todas estas pruebas son invasivas e implican un aumento del riesgo de aborto. Por tanto, habitualmente se recomiendan para mujeres de más de 35 años de edad, o mujeres que en un embarazo anterior han tenido un hijo afectado por trastornos cromosómicos o cuando la ecografía identifica un feto con una malformación.

El descubrimiento de la existencia de células fetales, aunque poco común, en la circulación materna ha llevado a muchos grupos a investigar y desarrollar métodos para el aislamiento y la recuperación de dichas células que permiten el diagnóstico prenatal no invasivo. En particular, existen tres tipos principales de células fetales que pueden pasar a través de la barrera placentaria: los linfocitos, los trofoblastos y los eritroblastos. De éstos, se ha 20 dirigido la investigación sobre todo al estudio de métodos para el aislamiento de eritroblastos fetales de la sangre materna periférica y trofoblastos, células epiteliales que se derivan de la placenta. El aislamiento de los trofoblastos de la sangre periférica está limitado por su morfología multinucleada, mientras que se ha demostrado [8-13] que estas células están presentes, entre la 6ª y la 15ª de gestación, en muestras transcervicales. Debe observarse que los trofoblastos que migran desde la placenta se adhieren a menudo a otros trofoblastos o células maternas formando agrupaciones.

La identificación de células fetales también se ha hecho posible recientemente mediante métodos de biología molecular aplicados directamente a células fetales no cultivadas. Dichos métodos son por ejemplo FISH (hibridación fluorescente in situ) prenatal y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente (QF-PCR) . La QF-PCR es un método que puede identificar y cuantificar simultáneamente secuencias de ADN específicas de cromosomas que, pudiendo aplicarse a células individuales, ha permitido el análisis genético basándose en un número muy pequeño de células fetales. En la bibliografía, existen numerosas publicaciones, incluyendo algunas revisiones [1-6, véase la Bibliografía al final de la descripción], cuyo contenido se incorpora al presente documento para las partes necesarias mediante simple referencia, referentes al uso de QF-PCR en análisis prenatales.

D.W. Bianchi y colaboradores desarrollaron [14-27] un sistema de aislamiento de los eritrocitos nucleados fetales (NRBC) de sangre materna basándose en puntuación multiparamétrica; los parámetros incluyen dos características morfológicas (circularidad y morfología del núcleo) y dos propiedades del marcaje de hemoglobina fetal (intensidad de fluorescencia y luminosidad periférica del citoplasma) . El protocolo prevé la separación de las células mononucleadas con gradiente de densidad y enriquecimiento mediante reducción de los leucocitos (MACS con anticuerpos para CD15 y CD45) y aislamiento en citofluorímetro con método FACS usando un anticuerpo anti

hemoglobina gamma. Las células identificadas mediante la puntuación multiparamétrica se recuperan usando un micromanipulador bajo observación microscópica.

El sistema de puntuación es muy laborioso y el uso del micromanipulador provoca la pérdida de parte de las células. En general, este método ha mostrado una sensibilidad del 74% en la recuperación de células fetales combinada con una frecuencia de falsos positivos del 5%.

La separación de las células mononucleadas con gradiente de densidad y enriquecimiento de la muestra mediante MACS con reducción de las células CD71+, marcadas adicionalmente con anticuerpos específicos para las cadenas gamma y épsilon de hemoglobina fetal, también se conoce a partir de otros trabajos [7]. Dicho marcaje puede producir, sin embargo, resultados no específicos, ya que existen casos de producción de hemoglobina fetal en células de adulto, o debido a la reticulación entre el anticuerpo para la hemoglobina fetal y la hemoglobina de adulto,

provocada por la similitud de estas cadenas de hemoglobina.

MonaLiza Medical Ltd. (patente estadounidense 2005/0181429 A1) desarrolló un método de análisis genético prenatal usando células transcervicales. El método se basa en el uso de un cepillo para citología vaginal para la recuperación de muestras transcervicales, que se procesan por medio de citocentrifugación para la preparación de portaobjetos. Las células transcervicales se marcan y se analizan bajo el microscopio y se memorizan su ubicación y coordenadas en el portaobjetos. El portaobjetos se analiza en FISH y se identifican las células trofoblásticas usando las coordenadas obtenidas previamente. La desventaja de dicho método es que durante el procesamiento para la preparación del portaobjetos, parte de las células transcervicales se pierden, sin obtener un resultado claro (no-call) debido a la falta de trofoblastos.

AVIVA-Biosciences Corporation (véase, por ejemplo, el documento EP-A-1439897) desarrolló un sistema de enriquecimiento basado en biochips para aislar células fetales de sangre materna. Este método usa un reactivo que permite la retirada de la mayoría de los eritrocitos, la clasificación por medio de perlas magnéticas altamente específicas y un cóctel de anticuerpos específicos para antígenos fetales y enriquecimiento por medio de cámaras de filtración de alta resolución con poros que tienen diámetro variable según el tipo de células que vaya a aislarse. Nagy Gyula Richard et al, “Isolation of... “, Prenatal Diagnosis, vol. 25, N.º 5, mayo de 2005, páginas 398-402 describen el aislamiento de células fetales positivas para la cadena épsilon de hemoglobina con micromanipulación.

Dicho método, sin embargo, está restringido a la selección de células fetales por medio de enriquecimiento de la muestra, lo que no limita la posibilidad de haber contaminado células maternas y por tanto el consiguiente riesgo de un análisis genético no fiable.

Brevemente, ninguno de los métodos no invasivos mencionados anteriormente ha demostrado hasta el momento que pueda usarse como práctica de rutina para el diagnóstico de aneuploidías y/u otros defectos cromosómicos fetales.

El objetivo de la presente invención es, por tanto, proporcionar un método para el diagnóstico prenatal no invasivo, basado en la toma de muestras de un fluido materno orgánico, con alta probabilidad de contener células nucleadas fetales circulantes y su posterior aislamiento, en particular un fluido uterino, endocervical o transcervical, o sangre materna periférica. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método para el diagnóstico prenatal que puede automatizarse, sin falsos negativos, y con un número pequeño de falsos positivos y resultados que no son claros.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a métodos para el diagnóstico prenatal no invasivo, en particular para la identificación de anomalías genéticas en el feto.

Según la presente invención, por tanto, el diagnóstico se realiza basándose en un fluido materno orgánico con alta probabilidad de contener células nucleadas fetales y el posterior aislamiento de las mismas, en particular a partir de un fluido uterino, endocervical o transcervical o sangre materna periférica, identificar y analizar las células fetales presentes en el mismo, procediendo según el método de la reivindicación 1.

Según la presente invención, el fluido uterino, endocervical o transcervical o la sangre materna periférica se procesa en primer lugar mediante una o más etapas de enriquecimiento de las células nucleadas fetales. El método se caracteriza por el uso de un sistema microfluídico que puede seleccionar individualmente, de manera fácilmente automatizable y repetible, células únicas de la muestra enriquecida. Por medio de un sistema microfluídico de aislamiento de células únicas, es posible obtener un conjunto de células fetales con pureza suficiente para realizar un diagnóstico... [Seguir leyendo]

1. Método para el diagnóstico prenatal no invasivo que comprende las siguientes etapas de:

a. obtener una muestra de un fluido orgánico que tiene una alta probabilidad de contener células nucleadas fetales de una mujer embarazada;

b. enriquecer dicha muestra de fluido orgánico en al menos una población de células que comprende al menos un tipo de células nucleadas fetales;

c. aislar al menos una célula de entre dicho al menos un tipo de células nucleadas fetales;

d. realizar un análisis genético con dicha al menos una célula aislada de entre dicho al menos un tipo de

células nucleadas fetales con el fin de poner de manifiesto al menos una característica genética de dicha al 10 menos una célula nucleada fetal adecuada para permitir dicho diagnóstico;

caracterizado porque i) el método comprende una fase de marcaje de las células fetales con un anticuerpo específico para las células fetales adecuado para discriminarlas de las maternales; y

ii) dicha etapa de aislar al menos una célula de entre dicho al menos un tipo de células nucleadas fetales se 15 realiza seleccionando individualmente células únicas en un dispositivo microfluídico diseñado para dicho fin; y

iii) dicha etapa de aislar al menos una célula fetal se realiza seleccionando individualmente células únicas presentes en dicho dispositivo microfluídico, marcadas previamente con dicho anticuerpo específico.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha etapa de aislar al menos una célula de entre dicho al menos un tipo de células nucleadas fetales se realiza capturando células únicas, preferiblemente cada una en un sitio específico de una pluralidad de sitios de dicho dispositivo microfluídico situados en el dispositivo microfluídico según una disposición, y posteriormente seleccionar células únicas de entre las células capturadas, basándose en al menos un parámetro que puede detectarse por medio de un sensor interno o externo al dispositivo microfluídico.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha etapa de enriquecer dicha muestra de dicho fluido orgánico comprende una selección de células realizada basándose en al menos un parámetro elegido del grupo que consiste en:

a. densidad;

b. morfología; 30 c. propiedades eléctricas;

d. propiedades químicas;

e. propiedades mecánicas;

f. expresión de antígenos de superficie;

g. expresión de antígenos intracitoplasmáticos; 35 h. propiedades dieléctricas;

i. propiedades magnéticas;

o combinaciones de las mismas.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha etapa de enriquecer dicha muestra de dicho fluido orgánico en al menos una población de células que comprende al menos un tipo de células nucleadas 40 fetales comprende la etapa de tratar dicha muestra de dicho fluido orgánico con el fin de separar las células nucleadas y por consiguiente enriquecerlo en células nucleadas.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha etapa de tratar la muestra de dicho fluido orgánico con el fin de separar las células nucleadas y por consiguiente enriquecerlo en células nucleadas comprende la etapa de centrifugar dicha muestra de dicho fluido orgánico en gradiente de densidad.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha etapa de enriquecimiento comprende una selección realizada basándose en al menos una de las siguientes características de dicha población de células que comprende al menos un tipo de células nucleadas fetales:

a. expresan el antígeno de superficie CD71;

b. expresan el antígeno de superficie CD34;

c. expresan el antígeno de superficie GPA;

d. no expresan el antígeno de superficie CD14;

e. no expresan el antígeno de superficie CD15;

f. no expresan el antígeno de superficie CD45.

7. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende la etapa de diluir dicha muestra de dicho fluido orgánico después de dicha etapa de enriquecimiento y antes de dicha etapa de aislamiento de al menos una célula de entre dicho al menos un tipo de células nucleadas fetales; dicha dilución se realiza basándose en un recuento del número de células nucleadas presentes en una parte de volumen preestablecido de dicha muestra, que se separa de la muestra de dicho fluido orgánico inmediatamente después de dicha etapa de enriquecimiento.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos una o ambas de dichas etapas de enriquecimiento y realización de un análisis genético se llevan a cabo en combinación con dicha etapa de aislamiento dentro de dicho dispositivo microfluídico usado para realizar la etapa de aislamiento.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque el dispositivo microfluídico usado está dotado de una pluralidad de diferentes cámaras, separadas unas de otras y conectadas hidráulicamente, delimitadas en al menos un lado por un único chip o por una pluralidad de chips separados, portando una disposición de electrodos que pueden activarse.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase de marcaje de las células fetales con un anticuerpo específico para las células fetales adecuado para discriminarlas de las maternales se realiza preferiblemente usando una variedad de anticuerpos dirigidos frente a un antígeno específico seleccionado del grupo que consiste en:

• anticuerpos que reconocen antígenos de trofoblastos fetales tales como: HLA-G

• anticuerpos que reconocen antígenos de superficie fetales tales como: antígenos i

• anticuerpos que reconocen antígenos intracelulares fetales tales como: cadenas de hemoglobina y y s.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho anticuerpo específico para las células fetales adecuado para discriminarlas de las maternales es un anticuerpo fluorescente.

12. Método según una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque dicho anticuerpo específico para las células fetales adecuado para discriminarlas de las maternales se conjuga con una perla fluorescente.

13. Método según una de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicha muestra de un fluido orgánico es una muestra de sangre que contiene al menos una población de células que comprende al menos un tipo de células nucleadas fetales, caracterizado porque comprende la fase de marcaje con un primer marcador específico para el núcleo celular, de células nucleadas de dicha muestra de sangre, y marcaje con un segundo marcador, distinguible del primero, de al menos dicha población de células que comprende al menos un tipo de células nucleadas fetales, en el que dicho segundo marcador es dicho anticuerpo específico para las células fetales adecuado para discriminarlas de las maternales, con el fin de seleccionar

en dicha etapa de aislar al menos una célula fetal, sólo células únicas que ponen de manifiesto la presencia de ambos de dichos marcadores primero y segundo.

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque ambos de dichos marcadores primero y segundo son marcadores fluorescentes que tienen emisión en una longitud de onda primera y segunda respectivamente, diferentes entre sí, preferiblemente en la longitud de onda del azul y el verde respectivamente.

15. Método según la reivindicación 14, caracterizado porque dicha fase de seleccionar individualmente células únicas en dicha etapa de aislar al menos una célula fetal se realiza detectando también la emisión de una tercera longitud de onda, preferiblemente en la longitud de onda del rojo, que puede generarse mediante autofluorescencia por dichas células en dicha muestra de dicho fluido orgánico, con el fin de seleccionar sólo células que emiten en ambas de dichas longitudes de onda primera y segunda pero que, al mismo tiempo, no emiten en dicha tercera longitud de onda.

16. Método según una de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque comprende, después del marcaje las células, una fase de fijación y permeabilización para la identificación de las células fetales por medio de un anticuerpo intracitoplasmático.

17. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha fase de análisis genético se realiza por medio de QF-PCR y comprende una fase de comparación entre información genética que lleva dicha al menos una célula nucleada fetal y al menos una célula nucleada materna.

18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha etapa de enriquecer dicha muestra de dicho fluido orgánico en al menos una población de células que comprende al menos un tipo de células nucleadas fetales comprende las fases de poner en un cultivo dicha muestra de dicho fluido orgánico enriquecido en dicha al menos una población de células que comprende al menos un tipo de células nucleadas fetales y posteriormente repetir con dicha muestra una fase de enriquecimiento.

19. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha muestra de dicho fluido orgánico contiene células seleccionadas del grupo que consiste en: células uterinas, transcervicales o endocervicales o sangre materna periférica.

20. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho dispositivo microfluídico para la selección de células únicas es un dispositivo desechable.