Método para preparar carboxipeptidasa activada.

Método para preparar una carboxipeptidasa activada en una célula fúngica,

donde una secuencia de ADN quecodifica una proforma modificada de la carboxipeptidasa, que incluye un sitio de escisión Kex2 insertado en unaposición de 0 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural en lacarboxipeptidasa de tipo salvaje, se expresa bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proforma modificadade la carboxipeptidasa, a partir de lo cual la prosecuencia se escinde en la célula para liberar la forma activa libre de lacarboxipeptidasa.

Método para preparar carboxipeptidasa activada Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a un método para preparar carboxipeptidasas activadas y a un método para usar las carboxipeptidasas activadas para la producción de insulina humana madura o análogos de insulina humana en células fúngicas.

Antecedentes de la invención [0002] La insulina es una hormona polipeptídica producida en las células beta de los islotes de Langerhans. La molécula de insulina activa es una molécula bicatenaria que consiste en una cadena B y una cadena A conectadas por dos puentes de disulfuro. La insulina se sintetiza como una proinsulina de molécula precursora con la estructura B-C-A, donde la cadena del péptido C conecta el residuo de aminoácidos C-terminal en la cadena B con el residuo de aminoácidos N-terminal en la cadena A. La insulina bicatenaria madura se forma por escisión in vivo del péptido C en el par de residuos de aminoácidos básicos situados en la unión con la cadena A y B. La cadena A y B están sujetas entre sí por dos puentes de disulfuro entre los residuos Cys A7 y B7 y A20 y B19, respectivamente. Además, la molécula de insulina biológicamente activa tiene un puente de disulfuro interno entre los residuos Cys en la posición A6 y A11.

Tras el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante, se han descrito numerosos métodos para producir insulina y precursores de la misma en células huésped genéticamente modificadas. Dado que E. coli no tiene la maquinaria celular para plegar el polipéptido expresado y establecer los puentes de disulfuro que conectan la cadena A y B en la insulina madura, esta estrategia incluye varios pasos de tratamiento in vitro, tal como el establecimiento in vitro de los puentes de disulfuro durante el replegado y la escisión posterior del péptido C.

A diferencia de E. coli, las eucariotas contienen la maquinaria necesaria para el plegado y el establecimiento de los puentes de disulfuro y así parece que serían buenos candidatos para la producción de insulina madura en organismos genéticamente modificados. Thim et al, en FEBS Letters, volumen 212, número 2, 307-312, divulgan la expresión de proinsulina humana y varios precursores de insulina con determinados péptidos C modificados. La patente estadounidense 4 914 026 divulga un proceso para preparar insulina madura en la levadura por inserción del gen de proinsulina humana enlazado a la secuencia líder del a-factor de levadura en una célula huésped de levadura y cultivando la célula de levadura transformada en un medio nutritivo bajo condiciones donde la proinsulina se expresa y secreta en forma madura.

La WO 97/03089 divulga la expresión de precursores de insulina con la fórmula BZA, donde B y A son las cadenas peptídicas A y B de insulina humana enlazadas por al menos un enlace de disulfuro y Z es un polipéptido que comprende al menos un sitio de escisión proteolítica. La WO 90/10075 revela procesos para preparar insulina y análogos de insulina basados en la expresión de un precursor de insulina o análogo de insulina en la levadura, que después de la recuperación inicial del caldo de fermentación se convierten enzimáticamente en insulina madura o análogo de insulina. Las moléculas precursoras comprenden determinados péptidos C modificados y pueden comprender además una extensión N-terminal de la cadena B de insulina. El péptido C modificado y la posible extensión N-terminal del péptido B están diseñados para no ser divididos en la célula de levadura y así los precursores se segregan como péptidos monocatenarios, donde la cadena A y B siguen conectadas por el péptido C modificado pero con puentes de disulfuro correctamente situados. El producto de insulina madura o de análogo de insulina se obtienen entonces por una serie de pasos enzimáticos in vitro posteriores para disociar el péptido C y posiblemente la extensión N-terminal. Estos pasos enzimáticos llevan mucho tiempo, son frecuentemente costosos e introducen impurezas adicionales que posteriormente se deben eliminar en pasos posteriores de proceso hacia abajo, como costosos pasos de cromatografía y similares.

Un proceso para preparar insulina madura en células animales creadas genéticamente que no son capaces de formar naturalmente gránulos secretores se describe en la patente estadounidense nº: 6 348 327.

La WO2008/037735 divulga un método para preparar insulina humana por cultivo de una células fúngica que comprende una secuencia de ADN que codifica un precursor que comprende al menos un sitio de escisión Kex2.

La WO2007/080256 divulga un método para preparar polipéptidos de insulina madurada mediante la reacción del precursor de insulina con una carboxipeptidasa.

El propósito de la presente invención es desarrollar una cepa de hongos capaz de producir carboxipeptidasas que se activen intracelularmente independientemente de la proteinasa A y B y, además, desarrollar un proceso para preparar insulina madura o análogos de insulina completamente procesados mediante tal carboxipeptidasa alternativamente activada, de modo que se eviten los pasos de proceso de purificación hacia abajo costosos y de larga duración.

Resumen de la invención [0010] En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una carboxipeptidasa activada en una célula fúngica, donde una secuencia de ADN que codifica una proforma modificada de la carboxipeptidasa, que incluye un sitio de escisión Kex2 insertado en una posición de 0 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácidos N-terminal natural en la carboxipeptidasa de tipo salvaje, se expresa bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proforma modificada de la carboxipeptidasa, a partir de lo cual la prosecuencia se escinde en la célula para liberar la forma activa libre de la carboxipeptidasa.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una carboxipeptidasa activada que comprende la expresión en una célula fúngica de una secuencia de ADN que codifica una proforma modificada de la carboxipeptidasa, que incluye un sitio de escisión Kex2 insertado, a partir de lo cual la proforma de la carboxipeptidasa se escinde en la célula para liberar la forma activa libre de la carboxipeptidasa.

En una forma de realización de la invención, el método comprende además un paso de aislamiento de la forma activa de la carboxipeptidasa de la célula fúngica.

En otra forma de realización de la invención, la célula fúngica tiene un gen PEP4 no funcional (el gen que codifica la proteinasa A) .

En una forma de realización de la invención, la célula fúngica tiene un gen PEP4 eliminado.

El sitio Kex2 insertado en la proforma de la carboxipeptidasa en una posición asegura la escisión eficaz de la proforma de la carboxipeptidasa para formar la forma madura activada de la carboxipeptidasa.

En una forma de realización de la presente invención, el sitio Kex2 se une directamente al residuo de aminoácido N-terminal natural en la carboxipeptidasa de tipo salvaje.

En otra forma de realización, el sitio Kex2 se introduce en una posición relativamente próxima al residuo de aminoácido N-terminal natural de la carboxipeptidasa. No obstante, el sitio Kex2 preferiblemente no debería ser de más de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos abajo o arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural de la carboxipeptidasa.

En una forma de realización de la invención, el sitio Kex2 se introduce a una distancia de 1 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos abajo o arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural en la carboxipeptidasa.

En una forma de realización de la invención, el sitio Kex2 se introduce a una distancia de 1 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural en la carboxipeptidasa.

En otra forma de realización de la invención, el sitio de escisión Kex2 se introduce a una distancia de 2-30 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural en la carboxipeptidasa.

En otra forma de realización de la invención, el sitio de escisión Kex2 se introduce a una distancia de 5-30 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural en la carboxipeptidasa.

En otra forma de realización de la invención, el sitio de escisión Kex2 se introduce a una distancia de 5-20 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural en la carboxipeptidasa.

En otra forma de realización, el sitio Kex2 se introduce a una distancia de 2-30, de 2-29, de 2-28, de 2- 27, de 226, de 2-25, de 2-24, de 2-23, de 2-22, de 2-21 o de 2-20 residuos... [Seguir leyendo]

1. Método para preparar una carboxipeptidasa activada en una célula fúngica, donde una secuencia de ADN que codifica una proforma modificada de la carboxipeptidasa, que incluye un sitio de escisión Kex2 insertado en una posición de 0 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural en la carboxipeptidasa de tipo salvaje, se expresa bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proforma modificada de la carboxipeptidasa, a partir de lo cual la prosecuencia se escinde en la célula para liberar la forma activa libre de la carboxipeptidasa.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además un paso de aislamiento de la forma activa de la carboxipeptidasa de la célula fúngica.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde la célula fúngica tiene un gen PEP4 no funcional (el gen que codifica la proteinasa A) . 15

4. Método según la reivindicación 1-3, donde la carboxipeptidasa es endógena de la célula fúngica huésped.

5. Método según la reivindicación 1, donde el sitio de escisión Kex2 se inserta en la prosecuencia a una distancia de 1 a

aproximadamente 30 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural en la forma de tipo 20 salvaje de la carboxipeptidasa.

6. Método según la reivindicación 1, donde el sitio de escisión Kex2 se inserta en la prosecuencia a una distancia de 520, 5-15 o 5-10 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido N-terminal natural en la forma de tipo salvaje de la carboxipeptidasa.

7. Método según la reivindicación 1, donde el sitio de escisión Kex2 se inserta en una posición de 2-20, 2-15 o 2-10 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido N-terminal de la enzima de carboxipeptidasa de tipo salvaje.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la carboxipeptidasa es CPY. 30

9. Método para preparar insulina humana madura o un derivado análogo, dicho método comprende la coexpresión en una célula fúngica de:

i) una secuencia de ADN que codifica un precursor de insulina humana o un derivado análogo que comprende una extensión C-terminal de la cadena B y ii) un ADN que codifica una proforma de una carboxipeptidasa que incluye un sitio de escisión Kex2 insertado en una posición de 1 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos arriba del residuo de aminoácido Nterminal natural en la carboxipeptidasa de tipo salvaje,

por lo cual, la extensión C-terminal de la cadena B de la molécula del precursor de insulina humana se escinde en la célula fúngica mediante la carboxipeptidasa coexpresada y activada y, a partir de lo cual, la insulina humana madura o un derivado análogo se aísla del medio de cultivo.

10. Método según la reivindicación 9, donde la molécula del precursor de insulina humana comprende la cadena B de 45 insulina humana o un derivado análogo, la cadena A de insulina humana o un derivado análogo y un péptido C que enlaza la cadena B y la cadena A entre sí, donde el péptido C comprende al menos un sitio de escisión Kex2 y la cadena B comprende una extensión C-terminal que facilita una escisión Kex2 más eficaz del péptido C en la célula fúngica.

11. Método según la reivindicación 9-10, donde la extensión C-terminal de la cadena B tiene hasta 4 residuos de aminoácidos.

12. Método según la reivindicación 11, donde la extensión C-terminal de la cadena B se selecciona del grupo que consiste en Leu-Ala, Phe-Leu, Leu-Gly, Leu-Leu, Leu-Met y Leu-Ile. 55

13. Método según la reivindicación 9-12, donde la proforma de la carboxipeptidasa se expresa bajo regulación de un promotor diferente de su propio promotor.

14. Método según la reivindicación 13, donde la carboxipeptidasa es la enzima CPY de la levadura y el promotor es el 60 promotor Kex2.