Método para la producción de una planta sin transgenes con un patrón de metilación alterado.

Un método para modificar el patrón de metilación de una secuencia diana de DNA de una célulavegetal,

que comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar un polinucleótido adecuado para la inducción de la metilacion de DNA dirigida por RNA endicha célula vegetal, comprendiendo dicho polinucleótido una secuencia que es complementaria a dichasecuencia diana de DNA de la citada célula vegetal y que está insertada en un intrón vegetal,

b) introducción de dicho polinucleótido en dicha célula vegetal,

c) expresión de dicho polinucleótido en dicha célula transformada, induciendo así la metilacion de DNAdirigida por RNA, y

d) determinación del patrón de metilación de dicha secuencia diana de DNA en dichas células transformadasde la planta.

Método para la producción de una planta sin transgenes con un patrón de metilación alterado Campo de la invención La presente invención se refiere a materiales y métodos para la producción de una planta sin transgenes que presenta patrones de metilación alterados. Ciertas formas de realización de la invención proporcionan métodos, ácidos nucleicos, vectores, células vegetales, plantas y equipos adecuados para producir una planta carente de todo material transgénico, y por tanto sin transgenes, pero que presenta un patrón de metilación de DNA alterado. La presente invención está relacionada además con métodos, ácidos nucleicos, vectores, células vegetales, plantas y equipos para la producción de una planta sin transgenes cuyo patrón de metilación alterado posibilita la expresión diferencial de un gen. Por último, la presente invención también abarca un método para modificar el patrón de metilación de una secuencia diana de DNA en una célula vegetal.

Descripción Hasta la fecha, la generación de organismos genéticamente modificados (OGM) , en particular plantas, se lleva a cabo normalmente bien mediante la inserción estable de una secuencia de nucleótidos exógena en el genoma del organismo, bien mediante la inactivación génica (knock-out) o la reducción de la expresión génica (knock-down) dirigida de una parte del genoma, p. ej. por recombinación homóloga o técnicas con RNA de interferencia. Sin embargo, estas estrategias provocan cambios heredables en la secuencia de DNA del genoma diana. En la mayor parte de casos, sobre todo en lo referente a la introducción de resistencia a antibióticos por métodos genéticos, el cultivo de tales plantas modificadas suscita una gran controversia entre el público, y su liberación en el medio ambiente permanece sometida a normativas y evaluaciones de riesgo muy estrictas en la Unión Europea y en muchos otros países. Esta situación explica el reducido número de plantas modificadas con técnicas de ingeniería genética y de productos derivados de las mismas que se comercializan actualmente en el mercado europeo. Lo mismo puede decirse de los mecanismos de silenciamiento génico basados en RNA, principalmente la silenciación génica postranscripcional (PTGS, por sus siglas en inglés) o la metilación de DNA dirigida por RNA (RdDM, por sus siglas en inglés) , procesos que hasta ahora requieren de la presencia permanente de un constructo transgénico para mantener el efecto silenciador del gen en la planta de interés.

La WO 02/101059 se refiere a plantas o células vegetales transgénicas que tienen alterada la expresión de proteínas implicadas en el metabolismo del almidón. Los métodos descritos conciernen a constructos transgénicos que codifican especies de RNA utilizables para el silenciamiento dirigido de los genes que codifican dichas proteínas. No obstante, las susodichas restricciones impuestas al cultivo de OGM son igualmente aplicables a las plantas transgénicas descritas por esta invención.

A la vista de lo anterior, la presente invención tiene por objeto proporcionar métodos y/o materiales que permitan la modificación dirigida de rasgos heredables de una planta, como la expresión génica, pero en los cuales la secuencia del genoma de la planta queda exenta de cualquier cambio en los nucleótidos, eludiendo así los diversos problemas e inconvenientes vinculados al cultivo de las plantas genéticamente modificadas.

En un aspecto de la presente invención, este propósito se resuelve con un método para modificar el patrón de metilación de una secuencia diana de DNA de una célula vegetal que comprende los siguientes pasos: a) proporcionar un polinucleótido adecuado para la inducción de la metilación de DNA dirigida por RNA en dicha célula vegetal, comprendiendo dicho polinucleótido una secuencia que es complementaria a la dicha secuencia diana de DNA de dicha célula vegetal; b) introducción de dicho polinucleótido en dicha célula vegetal; c) expresión de dicho polinucleótido en dicha célula transformada, induciendo así la metilación de DNA dirigida por RNA; y d) determinar el patrón de metilación de dicha secuencia diana de DNA en dichas células transformadas de la planta.

Otro aspecto preferido se refiere a un método para producir una planta sin transgenes que presente un patrón de metilación alterado en una secuencia diana de DNA. Tal y como se describe en la presente memoria, el método está basado en la metilación de DNA dirigida por RNA, que comprende básicamente los pasos siguientes: a) proporcionar un polinucleótido adecuado para la inducción de la metilación de DNA dirigida por RNA en dicha planta, comprendiendo dicho polinucleótido una secuencia que es complementaria a dicha secuencia diana de DNA. Normalmente tales nucleótidos son moléculas de dsRNA, en particular horquillas de RNA que pueden expresarse fácilmente en células vegetales. El paso b) de dicho método comprende la introducción de dicho polinucleótido en las células de una planta. Más adelante se analizan con más detalle diversas metodologías para la transformación de plantas. El paso c) de dicho método comprende la expresión de dichos polinucleótidos en las células transformadas. La expresión de un polinucleótido de la invención en células de la planta induce la metilación de DNA dirigida por RNA de la secuencia diana de DNA. En el paso d) se determina el patrón de metilación de dicha secuencia diana de DNA en las células transformadas de la planta. Los medios para llevar a cabo el análisis de los patrones de metilación en un DNA dado se describen abajo. En el paso e) se selecciona una planta transformada que presenta un patrón de metilación alterado en la secuencia diana de DNA y que después se cruza genéticamente consigo misma.

En el paso f) se selecciona una planta entre la descendencia del cruzamiento del paso e) ; esta planta seleccionada se caracteriza por carecer del polinucleótido introducido según lo indicado en el paso b) . Por tanto, el producto final del método descrito es una planta que contiene una secuencia diana de DNA, endógena o transgénica, que presenta citosinas metiladas, pero, esto es importante, sin que la planta contenga resto alguno del polinucleótido transgénico que ha sido necesario para inducir la metilación.

Los mecanismos de silenciamiento mediados por RNA pueden interferir con la expresión génica a diferentes niveles: algunos mecanismos dirigidos por RNA actúan a nivel postranscripcional degradando determinados RNA mensajeros. Sin embargo, las especies derivadas de dsRNA también pueden provocar cambios directos en la estructura cromatínica de las regiones de DNA con las que comparten identidad de secuencia. Por ejemplo, las plantas utilizan tales especies de RNA para fijar patrones de metilación de citosinas en secuencias de DNA idénticas, proporcionando así una marca fundamental para la formación de la heterocromatina transcripcionalmente inactiva. Este proceso se refiere en general a la metilación de DNA dirigida por RNA (RdDM) .

La RdDM se inicia por la presencia de moléculas bicatenarias de RNA (dsRNA) en el núcleo celular. Estas moléculas pueden desencadenar la metilación de novo de todas las citosinas situadas en las regiones de DNA complementarias a la secuencia del RNA bicatenario. Como consecuencia de ello, tanto en mamíferos como en plantas, las posiciones metiladas del DNA sirven como hitos para la remodelación de la cromatina circundante, de forma que en esos loci se puede formar heterocromatina densa. Ese entorno de cromatina densa impide que otras proteínas entren en contacto con el DNA. En particular, los factores de transcripción o los componentes de la máquina transcripcional no pueden ensamblarse sobre las secuencias promotoras metiladas y la transcripción no puede tener lugar en tales regiones. Está comprobado que los genes que poseen secuencias reguladoras metiladas se transcriben menos y por ende también se expresan menos.

Una vez que un residuo simétrico de citosina (CpG) queda metilado en un DNA vegetal ciertas enzimas, las DNAmetiltransferasas, reconocen este sustrato después de la replicación del DNA y pueden metilar la misma posición de citosina en la hebra hija; las posiciones no metiladas permanecen sin metilar. De ese modo es posible transmitir un mismo patrón de metilación del DNA durante muchas generaciones. Para su sorpresa, los inventores descubrieron que los característicos cambios epigenéticos heredables introducidos por la RdDM con el método de la presente invención pueden ser empleados para alterar la expresión de un gen diana de una planta, pero sin que el material genómico de la planta resulte modificado en absoluto.

Las moléculas que se utilizan normalmente para inducir la RdDM en plantas... [Seguir leyendo]

1. Un método para modificar el patrón de metilación de una secuencia diana de DNA de una célula vegetal, que comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar un polinucleótido adecuado para la inducción de la metilacion de DNA dirigida por RNA en dicha célula vegetal, comprendiendo dicho polinucleótido una secuencia que es complementaria a dicha secuencia diana de DNA de la citada célula vegetal y que está insertada en un intrón vegetal,

b) introducción de dicho polinucleótido en dicha célula vegetal,

c) expresión de dicho polinucleótido en dicha célula transformada, induciendo así la metilacion de DNA dirigida por RNA, y

d) determinación del patrón de metilación de dicha secuencia diana de DNA en dichas células transformadas de la planta.

2. Un método para producir una planta sin transgén con un patrón de metilación alterado en una secuencia diana de DNA de la misma, que comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar un polinucleótido adecuado para la inducción de la metilacion de DNA dirigida por RNA en dicha planta, dicho polinucleótido comprendiendo una secuencia que es complementaria a dicha secuencia diana de DNA,

b) introducción de dicho polinucleótido en células de una planta,

c) expresión de dicho polinucleótido en dichas células transformadas, induciendo así la metilación de DNA dirigida por RNA,

d) determinación del patrón de metilación de dicha secuencia diana de DNA en dichas células transformadas de la planta,

e) selección y autocruzamiento de una planta transformada que presenta un patrón de metilación alterado en dicha secuencia diana de DNA, y

f) selección de una planta de la descendencia del cruce de e) que se caracteriza por carecer del citado polinucleótido introducido con arreglo l paso b) .

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho polinucleótido codifica un dsRNA, preferiblemente una horquilla de dsRNA que está codificada por secuencias con sentido y antisentido contiguas que están separadas por un espaciador.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que dicho polinucleótido está insertado en un intrón vegetal.

5. El método según la reivindicación 4, en el que dicho intrón vegetal comprende un sitio de ayuste GT cinco prima y un sitio de ayuste AG tres prima, y además tiene, antes de la inserción de cualquier secuencia adicional, un tamaño final aproximado de al menos 70 pares de bases.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho polinucleótido está enlazado funcionalmente a un promotor y a un sitio de poliadenilación, en el que dicho promotor se caracteriza porque es funcional en dicha célula de dicha planta.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha secuencia diana de DNA vegetal es una secuencia reguladora endógena que regula la transcripción del DNA vegetal, preferiblemente seleccionada entre, aunque no limitada a, secuencias promotoras endógenas, intensificadores, silenciadores, límites exón-intrón, UTR cinco prima, UTR tres prima, o aislantes.

8. Un método para la producción de una planta sin transgén que presenta un perfil de expresión génica alterado en un gen diana, comprendiendo un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, y g) determinación de la expresión génica de dicho gen diana.

9. Uso de una planta producida con arreglo a un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 para la producción de semillas, frutos, tallos, raíces y hojas u otros productos derivados de la planta con una expresión reducida de un gen, preferiblemente un gen que codifica un producto que es dañino para animales, seres humanos o plantas, preferiblemente genes que codifiquen alérgenos o genes que influyan en el nivel de sustancias bioquímicas venenosas de una planta, o un gen que codifique un rasgo indeseado como por

ejemplo un gen implicado en la aparición de la sobremaduración.