MÉTODO PARA EVALUAR LA SUSCEPTIBILIDAD DE UNA POBLACIÓN MICROBIANA ANTE FÁRMACOS MEDIANTE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN).

Método para evaluar la susceptibilidad de una población microbiana ante fármacos mediante resonancia magnética nuclear (RMN),

que comprende: preparar una muestra del medio de cultivo apta para ser analizada por RMN, preparar una muestra apta para ser analizada por RMN de la población microbiana, añadir el fármaco antimicrobiano a una muestra igual que la de la etapa b), y analizar y/o cuantificar por RMN el resultado obtenido de las etapas anteriores utilizando unos controles adecuados.

Método para evaluar la susceptibilidad de una población microbiana ante fármacos mediante resonancia magnética nuclear (RMN) .

Objeto de la invención La presente invención se refiere a un método para evaluar la susceptibilidad de una población microbiana ante fármacos mediante resonancia magnética nuclear (RMN) , el cual se encuentra dentro del sector de las técnicas de análisis de susceptibilidad antimicrobiana de fármacos.

Estado de la técnica

Existen numerosos métodos convencionales estandarizados utilizados para determinar la susceptibilidad antimicrobiana, los cuales, a menudo, son lentos y laboriosos. Frecuentemente, estos métodos muestran problemas tanto en la precisión como en la reproducibilidad, lo que se corresponde con una mala correlación con el resultado terapéutico.

Hay bacterias que necesitan condiciones especiales para su manejo y crecimiento, lo que dificulta la realización de estudios de susceptibilidad antimicrobiana. Además, existen pocos estudios in vitro de susceptibilidad antimicrobiana frente a estas bacterias, debido a que son bacterias intracelulares obligadas que necesitan sistemas de cultivo celular para llevarlos a cabo, tal como propone Rolain JM et al., en “In vitro susceptibilities of 27 rickettsiae to 13 antimicrobials” (Antimicrob Agents Chemother 1998; 42:1537-1541) .

Los resultados obtenidos mediante los métodos de referencia disponibles deben ser interpretados con precaución ya que, muchas veces, los datos no pueden extrapolarse directamente a los regímenes de tratamiento usados en la práctica clínica como establecen y, por tanto, no predicen la eficacia terapéutica:

-Raoult D. et al. “Antimicrobial therapy of rickettsial diseases” (Antimicrob Agents Chemother 1991; 35:24572462) .

-Maurin M. et al.“In vitro susceptibilities of spotted fever group rickettsiae and Coxiella burnetti to clarithromycin” (Antimicrob Agents Chemother 1993; 37:2633-2637) .

En los últimos años han surgido nuevos métodos basados en técnicas moleculares que han ayudado al estudio de la susceptibilidad antibiótica en estos patógenos de difícil manejo. El método de IFI (inmunofluorescencia indirecta) requiere mucho tiempo para lograr la obtención de resultados y, además, no son muy consistentes con la experiencia clínica lo que sugiere la reconsideración del método de Ives TJ, et al.“In vitro susceptibilities of Rickettsia and Bartonella spp. to 14-hydroxy-clarithromycin as determined by immunofluorescent antibody analysis of infected vero cell monolayers” (J Antimicrob Chemother 2000; 45:305-310) . La técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) a tiempo real, a pesar de los buenos resultados obtenidos, todavía debe ser desarrollada, adaptada y estandarizada como establece Rolain JM, et al. “Evaluation of antibiotic susceptibilities of three rickettsial species including Rickettsia felis by a quantitative PCR DNA assay” (Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:2747-2751) .

Descripción de la invención La presente invención desarrolla un método o técnica que es útil para determinar la susceptibilidad a fármacos antimicrobianos mediante la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) , como alternativa para el estudio del metabolismo bacteriano.

El estudio de susceptibilidad antimicrobiana tiene como objetivo primordial determinar el fármaco más específico para la terapia de un paciente que sufre un proceso de tipo infeccioso. Se trata de métodos in vitro con unas condiciones estandarizadas, que son útiles frente a agentes patógenos cuya susceptibilidad a fármacos no sea predecible o en aquellos microorganismos que hayan adquirido mecanismos de resistencia.

Al contrario que otras técnicas analíticas, el método o técnica que se propone aquí emplea la espectroscopia de RMN para el análisis de mezclas. Como consecuencia, los resultados obtenidos son cuantitativos, altamente reproducibles y robustos. Basta una simple preparación de la muestra, que además, puede ser estudiada a menudo en su estado natural, sin necesidad de tratamiento previo.

La metabolómica y la metabonómica se desarrollan en el ámbito de la RMN y permiten analizar mezclas directamente, y, en colaboración con métodos de análisis estadístico y quimiométrico, permiten estudiar los resultados obtenidos.

En lo que respecta a la investigación de sistemas biológicos, se pueden distinguir tres tipos de aplicaciones: -En primer lugar, el estudio de la estructura y función de macromoléculas. -En segundo lugar, el estudio de los cambios metabólicos en organismos ante estímulos externos, por medio de la

identificación y cuantificación de metabolitos (metabolómica/metabonómica) .

-Por último, la obtención de imágenes in vivo con la técnica de tomografía por resonancia magnética, utilizada en diagnóstico médico.

El método de la presente invención, para evaluar la susceptibilidad de una población microbiana ante fármacos mediante resonancia magnética nuclear (RMN) , comprende: a) preparar una muestra del medio de cultivo apta para ser analizada por RMN, b) preparar una muestra apta para ser analizada por RMN de dicha población microbiana, c) añadir el fármaco antimicrobiano a una muestra igual que la de la etapa b) , y d) analizar y/o cuantificar por RMN el resultado obtenido de las etapas anteriores utilizando unos controles adecuados.

De modo preferente, en el método descrito anteriormente, los controles de la etapa d) comprenden: -obtener el espectro RMN E0 del medio de cultivo, -obtener el espectro RMN E1 de la población microbiana, -obtener el espectro RMN E2 de dicha población microbiana una vez añadido el fármaco antimicrobiano a distintos tiempos, -determinar las concentraciones mínimas inhibitorias, -determinar mediante el cálculo del punto final metabólico, la presencia de metabolitos en M2, punto final

metabólico del espectro RMN E2, asociados con el grado de efectividad del fármaco antimicrobiano, -comparar los espectros E0, E1 y E2, para identificar ausencia o reducción de picos entre ambos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un esquema general de los componentes de un equipo de RMN.

La figura 2 muestra un ejemplo de espectro con experimentos sobre Escherichia coli.

Descripción detallada de un modo de realización Equipo De forma general, el espectrómetro de RMN consta de varios componentes integrados, capaces de realizar todos los procesos necesarios para obtener un espectro de RMN a partir de una muestra: imán, sonda, consola y ordenador. Debido a la especial naturaleza de los estudios metabólicos (amplio rango de metabolitos para analizar, gran cantidad de muestras disponibles) se requiere un alto grado de automatización en los procesos de preparación de la muestra, realización del análisis y procesado y evaluación de los datos (que puede incluir trabajar con bases de datos) .

A continuación, se describirá de forma esquemática y desde un punto de vista metabólico, el equipamiento de un espectrómetro de RMN:

-el imán (1) es la parte fundamental del equipo, puesto que genera el campo magnético inductor de la magnetización. En la actualidad se basa en el uso de superconductores realizados con materiales que sólo presentan dicha propiedad a temperaturas cercanas al cero absoluto, por lo que deben estar inmersos en helio líquido. Cuanto más alto sea el campo magnético, mayor será la frecuencia de resonancia de los núcleos y se resolverán mejor las señales de los distintos metabolitos. En la actualidad, se han alcanzado campos de hasta 23.5 Teslas (o 1000 MHz de frecuencia para 1H) , pero dado su alto coste, la mayoría de estudios metabólicos citados en la literatura se han llevado a cabo en equipos de 400 y 600 MHz.

-la sonda (2) es el compartimento donde se coloca la muestra, bien en tubos de cristal de diversos diámetros

o en continuo a través de un capilar (sonda de flujo) . La sonda también posee los sensores para emitir pulsos de radiofrecuencia y recibir las señales de RMN de los núcleos. Recientemente, nuevos desarrollos tecnológicos en la sonda han permitido mejoras en la obtención de datos de la muestra, como las sondas criogénicas (que no congelan la muestra) y el RMN con rotación en ángulo mágico (HRMAS-NMR) que permite la RMN en estado sólido.

-la utilización de un sistema automatizado para introducir la muestra en la sonda es un requisito casi indispensable en los estudios de metabonómica, por la gran cantidad de muestras y los pequeños volúmenes disponibles. Para ello, se utilizan diversos cambiadores de muestras. En las sondas de flujo las muestras se colocan en... [Seguir leyendo]

1. Método para evaluar la susceptibilidad de una población microbiana ante fármacos mediante resonancia magnética nuclear (RMN) , caracterizado por que comprende: a) preparar una muestra del medio de cultivo apta para ser analizada por RMN, b) preparar una muestra apta para ser analizada por RMN de la población microbiana, c) añadir el fármaco antimicrobiano a una muestra igual que la de la etapa b) , y

d) analizar y/o cuantificar por RMN el resultado obtenido de las etapas anteriores utilizando unos controles adecuados.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dichos controles de la etapa d) comprenden: -obtener el espectro RMN E0 del medio de cultivo, -obtener el espectro RMN E1 de la población microbiana, -obtener el espectro RMN E2 de dicha población microbiana una vez añadido el fármaco antimicrobiano a distintos

tiempos,

-comparar los espectros E0, E1 y E2, para identificar ausencia o reducción de picos entre ellos,

-determinar, mediante el cálculo de M2, punto final metabólico del espectro RMN E2, la presencia de metabolitos

asociados con el grado de efectividad del fármaco antimicrobiano, -comparar dicho punto final metabólico, M2, con las concentraciones mínimas inhibitorias obtenidas de otros métodos.