Método para determinar la probabilidad de una respuesta terapéutica en la quimioterapia de cáncer con glicósido cardiaco.

Un método in vitro útil para predecir la capacidad de respuesta terapéutica in vivo de una enfermedad o trastorno,

que presenta una etiología asociada a una proliferación celular excesiva, frente a un tratamiento con un glicósido cardiaco o una composición que comprende una glicósido cardiaco, método que comprende:

determinar la relación de expresión de isoforma α3 a isoforma α1 de subunidad α de Na, K-ATPasa en una muestra de tejido celular enfermo obtenida previamente de manera directa o indirecta a partir de tejido celular in vivo de un sujeto con una enfermedad o trastorno que tiene una etiología asociada a una proliferación celular excesiva, comprendiendo dicha muestra una o más isoformas de la subunidad α de Na, K-ATPasa; y

determinar la probabilidad de una respuesta terapéutica en el sujeto, donde el sujeto debe ser tratado con una dosis terapéuticamente relevante de glicósido cardiaco;

donde la enfermedad o trastorno es cáncer, un tumor, artritis inducida por antígeno, encefalomielitis alérgica, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil de inicio sistémico, osteoporosis, soriasis, enfermedad fibroquística, hiperplasia prostática benigna, retinopatía diabética, aterosclerosis o estenosis coronaria.

Método para determinar la probabilidad de una respuesta terapéutica en la quimioterapia de cáncer con glicósido cardiaco.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método de determinación de la prognosis en la quimioterapia de cáncer con un glicósido cardiaco. En particular, la invención se refiere a un método para la determinación de la probabilidad de que una enfermedad o trastorno celular in vitro o in vivo que tenga una etiología asociada con una proliferación celular excesiva responda terapéuticamente al tratamiento con un glicósido cardiaco.

Antecedentes de la invención Muchas enfermedades y trastornos que tienen una etiología asociada a una proliferación celular excesiva son fatales. Los más comunes entre ellos son el cáncer y los tumores. Sin embargo, las enfermedades proliferativas nocancerosas también pueden constituir una amenaza para la vida, o producir una pérdida de calidad de vida. Éstas pueden incluir, por ejemplo: 1) enfermedades autoinmunes tales como la artritis inducida por antígeno y la encefalomielitis alérgica, 2) enfermedades proliferativas inflamatorias crónicas tales como la artritis reumatoide, la artritis crónica juvenil de inicio sistémico, la osteoporosis y la soriasis, 3) enfermedades proliferativas del pecho que incluyen la enfermedad fibroquística, 4) enfermedades proliferativas de la próstata que incluyen la hiperplasia prostática (BPH) , 5) enfermedades proliferativas del ojo, que incluyen la retinopatía diabética proliferativa, y 6) enfermedades proliferativas vasculares, que incluyen la aterosclerosis y la estenosis coronaria. Se han realizado muchos esfuerzos para desarrollar terapias curativas o paliativas para estas enfermedades y trastornos; sin embargo, no se ha desarrollado una terapia comprensiva o universalmente curativa, incluso a pesar de que se ha demostrado que numerosas estrategias de quimioterapia son efectivas contra varios cánceres, tumores y otros tipos de enfermedades proliferativas diferentes.

Los agentes quimioterapéuticos son prescritos por los médicos individualmente o en combinación para desarrollar regímenes que se ajusten a las necesidades de los pacientes individuales. Tanto es así que un obstáculo clave en el desarrollo de dichos regímenes a medida es la imprevisibilidad de la eficacia de los agentes quimioterapéuticos contra un cáncer específico o fenotipos tumorales específicos. Los médicos se ven obligados a enfrentarse a estas enfermedades mortales usando estrategias de ensayo-error. Deben basarse en la revisión histórica de los usos reconocidos o indicados de cada agente quimioterapéutico concreto y a partir de ahí especular o adivinar si un agente terapéutico individual particular, o una combinación de agentes terapéuticos, serán terapéuticamente eficaces contra el cáncer o tumor que el médico pretende curar. Dicha estrategia convencional tiene un éxito limitado en la clínica.

Los médicos necesitan un ensayo prognóstico que pueda predecir con un nivel razonable de certeza si un cáncer o fenotipo tumoral particular responderán terapéuticamente a un agente quimioterapéutico individual concreto o a una combinación concreta de agentes terapéuticos. Este tipo de ensayo prognóstico es extremadamente útil para agentes quimioterapéuticos que tienen una historia de uso limitada, tal como aquellos que acaban de aparecer en el sector clínico. Sería extremadamente beneficioso para los médicos poder disponer de un ensayo prognóstico de este tipo para uno o más agentes quimioterapéuticos.

Los estudios preclínicos y el examen retrospectivo de los datos de pacientes sugieren el valor potencial de los glicósidos cardiacos (por ej. Bufalina, digoxina, digitoxina, ouabaína y oleandrina) , en el tratamiento de varios cánceres que incluyen el cáncer de mama, de pulmón, de próstata y la leucemia, por ejemplo.

El documento WO 2007016176 describe un método para inhibir la proliferación de células cancerígenas que comprende el tratamiento de las células cancerosas con una cantidad efectiva de extracto de fluido supercrítico que comprende un glicósido cardiaco.

Uno de los mecanismos farmacológicos de acción de los glicósidos cardíacos implica su capacidad para unirse a la bomba de intercambio iónico, Na, K-ATPasa y para inhibir la actividad de esta enzima particular. La Na, K-ATPasa, la proteína transmembrana que cataliza el transporte activo de Na+ y K+ a través de la membrana plasmática, es un receptor de glicósidos cardiacos bien establecido. Esta enzima hidroliza ATP y usa la energía libre para dirigir el transporte de K+ al interior de la célula y de Na+ al exterior de la célula, en contra de sus gradientes electroquímicos (Hauptman, P. J., Garg, R. y Kelly, R. A. Cardiac glycosides in the next millieum. Prog. Cardiovasc. Dis. 41: 247-254, 1999) .

La Na, K-ATPasa está compuesta por dos subunidades heterodiméricas, la subunidad catalítica α y la subunidad glicosilada β. También existe una subunidad γ, pero no ha sido estudiada en detalle. La subunidad α tiene sitios de unión para ATP, Na+, K+ y glicósidos cardiacos. La subunidad β actúa para estabilizar la subunidad catalítica α y también puede desempeñar un papel regulador. Se han identificado cuatro isoformas α diferentes (α1, α2, α3, α4) y tres isoformas β diferentes (β1, β2, β3) en células de mamíferos. La expresión relativa de cada tipo se ve alterada marcadamente en estados normales y de enfermedad. La expresión de las isoformas α es específica del tipo de tejido y varía entre tejidos humanos y de roedor (Blanco, G. y Mercer, R. W. Isozymes of the Na, K-ATPase:

heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol. 275 (Renal Physiol. 44) : F633-F650, 1998) . También se ha publicado una expresión alterada de las isoformas de Na, K-ATPasa en cánceres humanos tales como el cáncer renal, pulmonar, hepatocelular y de colon, en comparación con las de los correspondientes tejidos normales (Rajasekaran, S. A., Ball, W. J., Bander, N. H., Pardee, J. D. y Rajasekaran, A.K. Reduced expression of beta subunit of Na/K-APTase in human clear cell renal cell carcinoma. J. Urol. 162: 574-580, 1999; Avila, J., Lecuona, E., Morales, M., Soriano, A., Alonso, T. y Martin-Vasallo, P. Opposite expression pattern of the human Na/K-ATPase beta-1 isoform in stomach and colon adenocarcinomas. Ann. N. Y. Acad. Sci. 834: 633-635, 1997; Espineda, C., Seligson, D. B., Ball, W. J., Rao, J., Palotie, A., Horvath, S., Huang, Y., Shi. T y Rajasekaran, A. K. Analysis of the Na, K-ATPase α-and β-subunit expression profiles of bladder cancer using tissue microarrays. Cancer 97: 1851868, 2003; Jung, M. H., Kim, S.C., Jeon, G. A., Kim, S. H., Kim, Y., Choi, K. S., Park, S. I., Joe, M. K. y Kimm, K. Identification of differentially expressed genes in normal and tumor human gastric tissue. Genomics 69: 281-286,

2000) . Adicionalmente, la afinidad aparente de los glicósidos cardiacos por las diferentes isoformas α es bastante diferente. La unión de glicósidos cardiacos a la isoforma α1 es inferior a la que se produce con las isoformas α2 y α3, que son 250 veces, o más, más sensibles a la inhibición por este tipo de fármaco (Blanco, G. y Mercer, R. W.

Isozymes of the Na, K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol. 275 (Renal Physiol. 44) : F633-F650, 1998) . Sakai et al. (FEBS Letters 563: 151-154, 2004) han publicado que la expresión de la isoforma de subunidad α3 se incrementa en células de cáncer colorrectal humano en comparación con células colorrectales normales.

La oleandrina y la oleandrigenina inhiben la proliferación de células de cáncer de próstata humano a través de la inducción de apoptosis, que es debida, al menos en parte, a un aumento del Ca2+ intracelular por la inhibición de Na, K-ATPasa (McConkey, D. J., Lin, Y., Nutt, L. K., Ozel, H. Z. y Newman, R. A. Cardiac glycosides stimulate Ca2+ increases and apoptosis in androgen-independent, metastatic human prostate adenocarcinoma cells. Cancer Res.

60: 3807-3812, 2000) . La oleandrina y la oleandrigenina también inhiben la exportación de factor de crecimiento 2 de fibroblastos a través de la interacción con la membrana y la inhibición de la actividad de Na, K-ATPasa (Smith, J. A., Madden, T., Vijjeswarapu, M. y Newman, R. A. Inhibition of export of fibroblast growth factor-2 (EGF-1) from the prostate cancer cell lines PC3 and DU145 by Anvirzel and its cardiac glycoside component, oleandrin. Biochem. Pharmacol. 62: 469-472, 2001) .

Aunque la subunidad α1 de la Na, K-ATPasa está presente en muchos tejidos debido a que el complejo a1β1... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro útil para predecir la capacidad de respuesta terapéutica in vivo de una enfermedad o trastorno, que presenta una etiología asociada a una proliferación celular excesiva, frente a un tratamiento con un glicósido cardiaco o una composición que comprende una glicósido cardiaco, método que comprende:

determinar la relación de expresión de isoforma α3 a isoforma α1 de subunidad α de Na, K-ATPasa en una muestra de tejido celular enfermo obtenida previamente de manera directa o indirecta a partir de tejido celular in vivo de un sujeto con una enfermedad o trastorno que tiene una etiología asociada a una proliferación celular excesiva, comprendiendo dicha muestra una o más isoformas de la subunidad α de Na, K-ATPasa; y

determinar la probabilidad de una respuesta terapéutica en el sujeto, donde el sujeto debe ser tratado con 10 una dosis terapéuticamente relevante de glicósido cardiaco;

donde la enfermedad o trastorno es cáncer, un tumor, artritis inducida por antígeno, encefalomielitis alérgica, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil de inicio sistémico, osteoporosis, soriasis, enfermedad fibroquística, hiperplasia prostática benigna, retinopatía diabética, aterosclerosis o estenosis coronaria.

2. El método de la reivindicación 1 que además comprende: predecir que el tejido celular responderá

terapéuticamente al tratamiento con un glicósido cardiaco si la relación es superior o igual a al menos 1, o predecir que el tejido celular responderá terapéuticamente al menos parcialmente al tratamiento con un glicósido cardiaco si la relación está dentro del intervalo de 0, 5 a 1, 0, o predecir que el tejido celular sustancialmente no responderá terapéuticamente al tratamiento con un glicósido cardiaco si la relación es inferior a 0, 3, o predecir que los tejidos enfermos que tengan una relación de isoformas de subunidad α dentro del intervalo de 1 a 100 tendrán mayor

capacidad de responder terapéuticamente que aquellos que tengan una relación de isoformas de subunidad α inferior a 1, o predecir que los tejidos en los que solo se detecta isoforma α3 y no se detecta isoforma α1 serán los que presenten mayor capacidad de respuesta terapéutica a los glicósidos cardiacos.

3. El método de la reivindicación 1, que además comprende predecir que el tejido celular responderá terapéuticamente al menos parcialmente al tratamiento con un glicósido cardiaco si la relación es ≥2, o predecir que el tejido celular responderá terapéuticamente al menos parcialmente al tratamiento con un glicósido cardiaco si la relación es ≥10, o predecir que el tejido celular responderá terapéuticamente al menos parcialmente al tratamiento con un glicósido cardiaco si la relación es ≥25, o predecir que el tejido celular responderá terapéuticamente al menos parcialmente al tratamiento con un glicósido cardiaco si la relación es ≥75.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la probabilidad de que se produzca una respuesta terapéutica al

menos parcial está relacionada con la relación de la isoforma α3 a la isoforma α1 de Na, K-ATPasa de acuerdo a la siguiente tabla:

Relación Probabilidad de que exista una respuesta terapéutica en el sujeto

0, 3 – 0, 45 ± 0, 05 De 20 a <30%

0, 5 – 0, 95 ± 0, 05 De 30 a 50%

>/= 1 ± 0, 05 >50%

>10 >75%

5. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación de la relación comprende cuantificar el nivel de expresión de la isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa y de la isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa en la muestra in vitro o en la muestra de biopsia, y calcular su relación, o la etapa de determinar la relación comprende la determinación de la cantidad de isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa respecto de la cantidad de isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa en la muestra in vitro, y calcular su relación.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra es tejido celular, masa celular, lisato celular, preparaciones de membrana preparadas a partir de éstos, o láminas de histopatología fijas de las mismas.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra comprende al menos dos isoformas de la subunidad α de la Na, K-ATPasa, o la muestra comprende al menos las isoformas α1 y α3 de la subunidad α de la Na, K-ATPasa.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que además comprende: lisar o romper las células, tejidos o muestras de biopsia; o fijar las secciones de tejido para examen histopatológico obtenidas previamente a 45 partir de tejido celular enfermo in vivo para forma la muestra, o llevar a cabo un ensayo Western blot y/o un ensayo de tinción inmunohistoquímica sobre la muestra para determinar la cantidad y la expresión relativa de isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa respecto de isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa en la muestra; y calcular su relación.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende: llevar a cabo un análisis radiométrico o densitométrico de un gel a fin de determinar el contenido de isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa respecto al contenido de isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa en la muestra, o llevar a cabo un análisis radiométrico o densitométrico de un gel a fin de detectar la presencia y la cantidad de isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa y la de isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa en la muestra.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende: comparar el contenido de isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa y el de isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa en la muestra respecto del contenido de isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa y/o el de isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa en una muestra de control positivo y/o en una muestra de control negativo, o comparar el contenido de isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa y el de isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa en una muestra de tejido en la que se sepa que sólo se da una de las dos subunidades, α3 o α1, como control.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que además comprende: proporcionar información que especifique cómo llevar a cabo los análisis de las isoformas α1 y α3 de la subunidad α de Na, K-ATPasa, y/o que además comprende proporcionar información que detalle cómo interpretar los datos prognósticos.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el glicósido cardiaco se selecciona del grupo que consiste en oleandrina, ouabaína, bufalina, digitoxina, digoxina, cinobufatalina, cinobufagina y resibufogenina.

13. El uso de un kit para llevar a cabo un método prognóstico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo dicho kit:

a) un primer anticuerpo primario que tiene afinidad de unión para la isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa; y

b) un segundo anticuerpo primario que tiene afinidad de unión para la isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa.

14. El uso de la reivindicación 13 en el que el kit comprende además: a) una composición de lisis; b) una muestra de control positivo que comprende la isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa; c) una muestra de control positivo que comprende la isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa y la isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa; d) una muestra de control negativo que comprende la isoforma de subunidad α1 de Na, K-ATPasa y que excluye la isoforma de subunidad α3 de Na, K-ATPasa; e) un anticuerpo secundario, HRP de IgG α anti-ratón de cabra (que puede usarse por ejemplo para la visualización de proteínas de interés) ; f) material formador de gel adecuado para el análisis electroforético de gel; g) marcador radiomarcado; h) instrucciones de uso del kit y eficacia del método prognóstico; i) densitómetro o radiómetro; j) medio líquido acuoso; k) kit de preparación de gel/membrana; l) disolución de bloqueo; m) tampón de lavado; n) materiales que comprende un kit de análisis de Western blot; u o) una combinación de los mismos.

15. El uso de la reivindicación 13 ó 14, en el que el anticuerpo secundario es peroxidasa de rábano de IgG α antiratón de cabra o comprende otros anticuerpos secundarios de especies diferentes al ratón activadas contra IgG de ratón con un marcador apropiado unido, tal como peroxidasa de rábano.

16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, en el que la muestra de control positivo se selecciona del grupo que consiste en tejido, masa celular, lisato celular y preparaciones de membrana preparadas a partir de los mismos, donde la muestra de control positivo se obtiene previamente mediante biopsia u otros medios de escisión quirúrgica.

17. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la muestra de control negativo se selecciona del grupo que consiste en tejido, masa celular o lisato celular y preparaciones de membrana preparadas a partir de los mismos, que no contengan la isoforma α3 de la subunidad α de Na, K-ATPasa.

18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende medios alternativos para determinar la composición relativa de la subunidad α de Na, K-ATPasa y su relación de isoformas, donde los medios alternativos comprenden: el uso de anticuerpos en un ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzima) o un sistema de tejido de proteína o de lisato celular; el uso de análisis Northern blot y técnicas relacionadas (por ejemplo, rt-PCR) para la medida de ARNm para diferentes isoformas de subunidad de Na, K-ATPasa; o el uso de un ensayo de tinción inmunohistoquímica.

19. El uso de un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, comprendiendo además dicho kit medios alternativos para determinar la composición relativa de la subunidad α de Na, K-ATPasa y su relación de isoformas, donde los medios alternativos comprenden: el uso de anticuerpos en un ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzima) o un sistema de tejido de proteína o de lisato celular; el uso de análisis Northern blot y técnicas relacionadas (por ejemplo, rt-PCR) para la medida de ARNm para diferentes isoformas de subunidad de Na, K-ATPasa; o el uso de un ensayo de tinción inmunohistoquímica.