Método para aumentar la tolerancia al estrés en plantas.

Un método para aumentar la tolerancia a la sequía o la tolerancia a la sal en una planta,

que comprende hacer que se sobreexprese una cofactor de molibdeno sulfurasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la planta.

Método para aumentar la tolerancia al estrés en plantas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para aumentar la tolerancia al estrés en plantas. Más específicamente, 5 el método de la presente invención es para mejorar la resistencia a la sequía y la tolerancia a la sal.

Antecedentes de la invención Las plantas responden a estímulos ambientales alterando en parte su perfil de expresión génica, lo que conduce finalmente a diversas respuestas adaptativas a niveles celular y de planta completa (Bray, 1993; Thomashow, 1999; Hasegawa et al., 2000; Zhu et al., 1997; Ingram y Bartel, 1996) . Un importante regulador de las respuestas de las 10 plantas a ambientes de estrés abiótico es la fitohormona ácido abscísico (ABA; del inglés, abscisic acid) . El ABA está implicado en las respuestas de las plantas a estreses abióticos tales como baja temperatura, sequía y salinidad, así como en la regulación del crecimiento y el desarrollo de las plantas, incluyendo la embriogénesis, la inactividad de las semillas, el crecimiento de brotes y raíces y la transpiración de las hojas (Koornneef et al., 1998; McCourt, 1999; Leung y Giraudat, 1998; Rock, 2000) . La evidencia de un papel del ABA en la regulación génica sensible al 15 estrés en las plantas ha sido doble. En primer lugar, bajo condiciones de estrés por frío, sequía o sal, las plantas acumulan una cantidad aumentada de ABA, ejerciendo el estrés por sequía el efecto más prominente sobre la acumulación de ABA. En segundo lugar, el ABA exógeno induce la expresión de muchos genes sensibles al estrés, y su capacidad de inducción por estrés está disminuida en plantas mutantes defectuosas en cuanto a la biosíntesis de ABA o a la sensibilidad al ABA. 20

Un análisis genético basado en el efecto inhibitorio del ABA sobre la germinación de semillas ha permitido producir mutantes con una biosíntesis reducida de ABA o una sensibilidad alterada al ABA (Koornneef et al., 1998; McCourt, 1999; Leung y Giraudat, 1998; Rock, 2000) . El primer grupo de mutantes en Arabidopsis incluye aba1, aba2 y aba3. El gen ABA1 codifica una zeaxantina epoxidasa que actúa en una etapa precoz de la biosíntesis de ABA convirtiendo zeaxantina en violaxantina. Hasta ahora no se ha comunicado la clonación molecular de ABA2 ni ABA3. 25 Los fenotipos comunes de estos mutantes aba incluyen pérdida de la inactividad de las semillas, resistencia de la germinación al estrés por NaCl, y marchitamiento cuando son transferidos de condiciones de humedad elevada a condiciones de humedad baja. La utilización de mutantes deficientes en ABA junto con mutantes sensibles a ABA en estudios de regulación génica por estrés condujo a la idea de que la expresión génica sensible al estrés en las plantas está mediada por vías tanto dependientes de ABA como independientes de ABA (Shinozaki y Yamaguchi-30 Shinozaki, 1977; Leung y Giraudat, 1998; Rock, 2000; Thomashow, 1999. Aunque los mecanismos moleculares que subyacen a las diferencias entre la regulación génica dependiente de ABA y la independiente de ABA no están claros, el análisis de los promotores de genes sensibles al estrés y el aislamiento de factores de transcripción que activan estos genes respaldan el hecho de que hay distintos mecanismos regulatorios para las diferentes vías. En estos promotores, el complejo ABRE [elemento sensible a ABA (del inglés, ABA-responsive element) ] media en la 35 inducción génica por ABA (Guiltinan et al., 1990; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994; Shen y Ho, 1995; Vasil et al., 1995) , mientras que el DRE/CRT (elemento sensible a la deshidratación) media en la sensibilidad al estrés osmótico y por frío independientemente de ABA (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994; Stockinger et al., 1997) . A pesar de estas diferencias en la activación transcripcional, el análisis genético ha indicado que las vías dependientes de ABA y las independientes de ABA presentan vastas interacciones o interferencias en cuanto al control de la 40 expresión génica bajo estreses abióticos (Ishitani et al., 1997; Xiong et al., 1999a) .

Como bien se aprecia en este campo técnico, aún existe la necesidad de métodos para mejorar la resistencia de las plantas a la sequía.

Sumario de la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar métodos y composiciones para aumentar la tolerancia al estrés 45 en las plantas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar plantas y células vegetales que tengan una resistencia aumentada al estrés.

Los objetos de la presente invención pueden ser llevados a cabo con un método para aumentar la tolerancia a la sequía o la tolerancia a la sal en una planta, que comprende hacer que se sobreexprese una cofactor de molibdeno 50 sulfurasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la planta. Preferiblemente, la cofactor de molibdeno sulfurasa es codificado por un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.

La presente invención ha sido llevada a cabo usando un planteamiento de gen informador para disecar genéticamente la transducción de señales de ABA y el estrés en Arabidopsis. Se construyeron plantas bioluminiscentes sensibles a ABA y al estrés introduciendo el gen informador de luciferasa de luciérnaga bajo el 55

control del promotor RD29A (que contiene tanto elementos ABRE como DRE/CRT; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994) en Arabidopsis. Se sometieron las plantas RD29A-LUC a mutagénesis y se aislaron mutantes con una bioluminiscencia anormal en respuesta al frío, la sequía, la sal o el ABA (Ishitani et al., 1997) . Un grupo de mutantes presenta respuestas de luminiscencia reducidas al estrés por NaCl. Aquí presentamos la caracterización y clonación de dos mutantes alélicos de este grupo. Estos dos mutantes, denominados los5-1 y los5-2 (baja expresión 5 de genes osmóticamente sensibles) , muestran una expresión reducida de genes sensibles al estrés bajo condiciones de estrés tanto osmótico como por frío. Aunque el papel de LOS5 en la regulación por estrés osmótico de la expresión génica es mediado por ABA, la regulación de la sensibilidad al frío por LOS5 no depende de ABA. La función de LOS5 en la expresión de genes sensibles al estrés osmótico y por frío es independiente de los factores de transcripción CBF/DREB1 y DREB2A. Las plantas mutantes los5 son más susceptibles al daño por estreses por 10 congelación, sal y sequía, lo que sugiere que LOS5 es crítico para la tolerancia de las plantas al estrés. Las plantas mutantes también muestran una pérdida aumentada de agua de transpiración y acumulan menos ABA en respuesta al estrés por sequía. Pruebas alélicas muestran que los5 es alélico con respecto a la mutación aba3. La clonación de LOS5/ABA3 basada en mapas revela que codifica una supuesta cofactor de molibdeno [MoCo (del inglés, molybdenum cofactor) ] sulfurasa que cataliza la sulfuración de la forma desulfo de MoCo, lo que es consistente con 15 hallazgos previos relativos a que la alteración en aba3 está en la introducción de S en MoCo (Schwartz et al., 1997a) . El MoCo sulfurilado es un cofactor de la ABA-aldehído oxidasa que actúa en la última etapa de la biosíntesis de ABA. La expresión del gen LOS5/ABA3 es suprarregulada por ABA y estreses por sal y sequía. Estos datos proporcionan importantes conocimientos sobre la biosíntesis de ABA y promueven significativamente la comprensión de la regulación génica por estrés y la tolerancia al estrés. 20

Se obtendrá fácilmente una apreciación más completa de la invención y de muchas de las ventajas concomitantes de la misma conforme la invención llegue a ser mejor conocida por referencia a las Figuras siguientes junto con la posterior descripción detallada.

Breve descripción de las Figuras Figura 1: Fenotipos de luminiscencia de plantas mutantes los5. 25

(A) Morfología de plantones los5-1 (derecha) y de tipo silvestre (izquierda) en una placa de agar.

(B) Luminiscencia de (A) después de un tratamiento a baja temperatura, a 0 °C, durante 48 horas.

(C) Morfología de plantones los5-1 (derecha) y de tipo silvestre (izquierda) en una placa de agar.

(D) Luminiscencia después de un tratamiento con ABA 100 µM durante 4 horas.

(E) Morfología de plantones los5-1 (derecha) y de tipo silvestre (izquierda) sobre papel de filtro saturado con NaCl 30 300 mM.

(F) Luminiscencia de (E) después de 5 horas de tratamiento con NaCl 300 mM.

(G) Cuantificación de las intensidades de luminiscencia de plantas los5-1 y de tipo silvestre en respuesta a tratamientos con frío (0 °C durante 48 horas) , ABA (100 µM durante 4 horas) o NaCl (300 mM durante 5 horas) , como se muestra en... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar la tolerancia a la sequía o la tolerancia a la sal en una planta, que comprende hacer que se sobreexprese una cofactor de molibdeno sulfurasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la planta.

2. El método de la Reivindicación 1, en donde la cofactor de molibdeno sulfurasa es codificada por un ácido 5 nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.