Método de producción escalable de AAV.

Un método para la producción de AAV, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) cultivar un AAV carente de un sitio de enlace de heparina en un cultivo celular, y

(b) aislar el AAV del sobrenadante del cultivo celular sin que se requiera la recogida de un sedimento celular ola disrupción celular.

Método de producción escalable de AAV.

Exposición relativa a la investigación o desarrollo patrocinados federalmente La presente solicitud describe un trabajo sustentado al menos en parte por una subvención de National Institutes of Health, subvención de NHLBI número P=1-HL-059407. El gobierno de US puede tener determinados derechos sobre la presente invención.

Antecedentes de la invención La invención describe una forma novedosa de cultivo y producción de AAV.

Un virus adeno asociado (AAV) , un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin cubierta, con un genoma de ADN lineal de cadena simple de 4, 7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV se asigna al género, Dependovirus, puesto que el virus fue descubierto como contaminante en poblaciones de adenovirus purificados. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que genomas de AAV, tras la infección, son integrados en genomas anfitrión, y una fase infecciosa en la que, a continuación de la infección por virus ya sea por adenovirus o ya sea por herpes simplex, los genomas de AAV integrados son rescatados posteriormente, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, la amplia gama de infectividad del anfitrión, incluyendo células sin división, y la integración, hacen que un AAV sea un vehículo de suministro atractivo.

Se ha descrito una diversidad de secuencias de AAV diferentes y de métodos para aislamiento de las mismas a partir de tejidos. Se ha descrito el AAV 1-6, AAV7, AAV9 y AAV9, entre otras secuencias de AAV obtenidas a partir de fuentes de tejido de simios o de humanos. Véanse, por ejemplo, las solicitudes de Patentes Internacionales núms. WO 02/33269, WO 02/386122 (AAV6) , y la solicitud de Patente Internacional núm. WO 2005/033321. Con todo esto, se ha producido un alejamiento en cuanto a definir un AAV estrictamente mediante la actividad serológica cruzada (serotipos) . La literatura reciente define la relación entre estos AAV en términos de relatividad filogenética, proponiendo grupos denominados “clados”. Véase, por ejemplo, Gao et al., J. Virol. 78 (12) : 6381-6388 (Junio de 2004) ; solicitud de Patente Internacional núm. WO 2005/033321.

La metodología actual para la producción de AAV ha estado fundamentada en gran medida en la observación de que el AAV2 está asociado a la célula y de ese modo, se cree que reside principalmente en las células productoras. Por lo tanto, la mayor parte de las estrategias de producción de AAV del estado actual de la técnica obtienen partículas de vector procedentes del sedimento celular de la línea celular de producción. Cada una de estas estrategias emplea alguna metodología de liberación de vector desde el sedimento celular mediante lisis por sonicación, enzimática, física o química. Esto libera desafortunadamente todas las proteínas intracelulares y los residuos en el cultivo viral. Por lo tanto, el procedimiento subsiguiente de purificación es más exigente. Debido a la eficacia relativamente baja tanto de la producción como de la purificación, es necesario empezar con una gran cantidad de células productoras.

Se necesitan por tanto métodos eficientes de producción y purificación de AAV.

Sumario de la invención La presente invención permite la producción de AAV sin que se requiera la terminación del cultivo celular de producción de virus. El método incluye cultivar AAV liberado en el sobrenadante sin que se requiera la recogida de un sedimento celular o la disrupción celular. Más en particular, la invención proporciona un método para la producción de AAV, comprendiendo dicho método las etapas de (a) cultivar un AAV carente de un sitio de enlace de heparina en un cultivo celular; y (b) aislar el AAV del sobrenadante del cultivo celular sin que se requiera la recogida de un sedimento celular o la disrupción celular. En una realización, el método incluye modificar los cápsides de AAV, las células y/o las condiciones de cultivo para reducir sustancialmente, o eliminar, el enlace entre el sitio de enlace de Heparina de AAV y las células productoras, permitiendo con ello que el AAV pase al sobrenadante, es decir, al medio. De ese modo, el método de la invención proporciona un sobrenadante que contiene altas producciones de AAV que tienen un grado de pureza más alto a partir de membranas celulares y de materiales intracelulares, en comparación con el AAV producido con la utilización de métodos que hacen uso de una etapa de recogida celular y/o de lisis celular.

Esta tecnología puede ser aplicada a la producción eficiente y escalable de AAV con mejoras significativas en cuanto a coste financiero e inversión de tiempo. Esta tecnología permite la producción de AAV a pequeña escala y su aplicación comercial para un kit de “todo incluido” a efectos de investigación. Puesto que el AAV puede ser cultivado múltiples veces a partir del sobrenadante, un sistema continuo o bio-reactor permite la producción de cantidades partículas necesarias para uso clínico o para una aplicación farmacéutica amplia sin que el substrato celular constituya una limitación para la producción. Opcionalmente, en combinación con el uso de un medio de crecimiento que carezca de, o que sea muy bajo en cuanto a, suero o proteínas, la purificación se simplifica considerablemente. Esta tecnología puede ser aplicada en combinación con métodos más eficientes de purificación y concentración que podrían ser utilizados con los métodos de producción de la técnica anterior y/o en presencia de cantidades significativas de material intracelular.

Otras ventajas adicionales de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada de la invención.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 ilustra el efecto de una glicoproteína de sulfato de heparano (HSPG) sobre la producción de AAV2 y de AAV2HSPG- en presencia (S) o ausencia (SF) de suero, con producción de AAV2/8 como control positivo.

La Figura 2ª muestra la cuantificación de partículas de AAV resistentes a DNasa (drp) en sobrenadante (I) , fracción celular pobremente asociada (II) y fracción celular estrechamente asociada (III) para control positivo de AAV2/8;

Las Figuras 2B-2E muestran fracciones similares para AAV2 y AAV2HSPG- en presencia (Suero o S) o ausencia (Exentas de Suero o SF) de suero;

La Figura 3 ilustra la producción de aislados de AAV a partir de transfección simple por plato de 15 cm. Todos los aislados con un enlace que no fuera de heparina produjeron una GC total mayor de 2 x 1012 comprendida en la gama de hasta 1 x 1013. Se ha mostrado el AAV2 y el hu.51 aislado para enlazar heparina y está limitado en cuanto a producción.

La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra los resultados de inmunización con una diversidad de AAV por activación de células T. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 1 x 1011 de vector de GC AAV2/6, AAV2/6.1, AAV2/6.2, AAV2/6.1.2, AAV2/1 y AAV2. 13 días más tarde se cultivaron esplenocitos a partir de 3 ratones por grupo y se agruparon. Iguales cantidades de esplenocitos fueron simuladas in vitro con epítope IPQYGYLTL [SEQ ID No. 1] de AAV de Balb/c en un ensayo ELISPOT.

La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra la fracción de vector liberada en el sobrenadante a continuación de la producción de vector viral de AAV especificada mediante triple transfección transitoria en un sistema de cultivo de células 293.

Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona un método para la producción de AAV, sin que se requiera disrupción celular. El método incluye cultivar AAV a partir del sobrenadante de un cultivo de producción viral.

Para aquellos AAVs que no muestren afinidad con proteoglicanos de sulfato de heparano o heparina, los cuales comprenden la mayor parte de las especies de AAV, una gran fracción de partículas infecciosas, resistentes a DNasa, se localiza en el sobrenadante del cultivo o está asociada a la célula solamente de manera pobre. Esto se observa sin lisis viral, osmolítica o de cualquier otro tipo.

La presente invención permite una tecnología escalable para la producción de AAV para su uso en una diversidad de transferencias de gen y/o aplicaciones de vacuna. La misma reduce también drásticamente la rigurosidad de la purificación cuando se usa en combinación con medios de contaminación baja, o nula, en proteínas, para el cultivo. Este método de producción puede ser aplicado en combinación con métodos adecuados de purificación y concentración que incluyen, por ejemplo, cromatografía, filtración o precipitación a efectos de purificación y concentración.

Puesto que la mayor parte de las estrategias... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de AAV, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) cultivar un AAV carente de un sitio de enlace de heparina en un cultivo celular, y

(b) aislar el AAV del sobrenadante del cultivo celular sin que se requiera la recogida de un sedimento celular o la disrupción celular.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método comprende además una o ambas de las etapas siguientes:

(c) mantener un cultivo celular viable, y

(d) añadir medio durante, o a continuación de, la recogida del sobrenadante para proporcionar un proceso de producción continuo. y, opcionalmente, repetir las etapas de método al menos dos veces y opcionalmente hasta 100 veces.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el AAV es AAV8. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el AAV ha sido modificado para la ablación de un sitio de enlace natural de heparina.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el sitio de enlace de heparina está caracterizado por la

secuencia de aminoácido RxxR (SEQ ID No. 12) , donde X es cualquier aminoácido. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el AAV se elige en el grupo consistente en AAV2, hu.51, hu.34, hu.35, hu.45 y hu.47.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el sitio de enlace de heparina se modifica según una o más de las siguientes maneras:

(a) se modifica el primer aminoácido de la secuencia RxxR (SEQ ID No. 12) ;

(b) se cambia el primer aminoácido de la RxxR (SEQ ID No. 12) desde Arg a Ser o Glu;

(c) se modifica el sitio de enlace de heparina en el último aminoácido de la secuencia RxxR (SEQ ID No. 12) , y/o

(d) se cambia el último aminoácido de la secuencia RxxR (SEQ ID No. 12) desde Arg a Thr.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de cultivo se realiza en un medio carente de suero.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el AAV se cultiva en una célula HEK 293.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de aislamiento comprende además concentrar AAV mediante un método elegido en el grupo consistente en cromatografía, cromatografía basada en columna, cromatografía basada en membrana, filtración y precipitación.

11. Un método para producir AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las células del cultivo celular (a) comprenden:

funciones auxiliares de adenovirus necesarias para empaquetamiento, una proteína rep de AAV suficiente para empaquetamiento, una proteína cap de AAV suficiente para empaquetamiento, y el genoma de AAV que va a ser empaquetado.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que las células son transformadas de manera estable con uno o más de lo siguiente:

(a) las secuencias que codifican las funciones auxiliares de adenovirus (estando opcionalmente las funciones auxiliares de dicho adenovirus expresadas bajo un promotor activable o inducible) ;

(b) las secuencias que codifican la proteína rep de AAV y/o la proteína cap de AAV (estando dichas proteína rep de AAV y/o proteína cap de AAV opcionalmente expresadas bajo la dirección de un promotor activable

o inducible) ; y/o

(c) el genoma de AAV que va a ser empaquetado.