Método de medición de la actividad funcional de la trombomodulina plasmática.

Un método de medición in vitro de la actividad funcional de la trombomodulina,

comprendiendo dicho métodoevaluar, en un medio biológico, a partir de una muestra biológica, la activación de la proteína C en proteína Cactivada (PCa) por la trombina en presencia de su cofactor, dicha trombomodulina, comprendiendo dicho métodola adición, al plasma de la muestra, de agentes necesarios para la activación del sistema de la proteína C, laadición de proteína C purificada y también la adición de un inhibidor de la polimerización de la fibrina.

Método de medición de la actividad funcional de la trombomodulina plasmática [0001] La invención se refiere al campo de la hemostasia y, en particular, a los trastornos de la coagulación.

La presente solicitud tiene por objeto un método para medir, en una muestra biológica, la actividad funcional de la trombomodulina plasmática.

De acuerdo con la invención, el método se realiza in vitro a partir de una muestra biológica, en particular, a partir de una muestra de sangre extraída de un paciente.

De acuerdo con la invención, el método permite medir la actividad funcional de la trombomodulina en un medio plasmático.

La presente solicitud se refiere en particular a un método para determinar la actividad funcional de la trombomodulina en un medio plasmático, realizándose dicha determinación, por ejemplo, mediante un método cromogénico o fluorométrico.

La trombomodulina (TM) es un proteoglicano receptor de la trombina integrado en la membrana de las células endoteliales. Es, en parte, responsable de las propiedades anticoagulantes del endotelio, es una proteína de 557 aminoácidos reagrupados en tres partes; una parte C-terminal intra-citoplasmática implicada en los mecanismos de endocitosis; una parte intra-membranosa hidrófoba; y una parte N-terminal constituida por una larga cadena peptídica. Esta última comprende cuatro regiones; una región rica en Ser/Thr, seguida de una región de seis dominios homólogos al factor de crecimiento epidérmico (EGF-like) , una región hidrófoba y, por último, un dominio similar a lectina, (Figura 1) .

En 1981, Owen W.G. y Esmon C.T. caracterizaron la actividad funcional de la trombomodulina (Proceedings of the National Academy of Science USA, 1981, vol. 78, páginas 2249-52 y Journal of Biological Chemistr y 1981 vol. 256, páginas 6632-5) poniendo de manifiesto una activación de la proteína C plasmática en proteína C activada anticoagulante, por la trombina, catalizada por la trombomodulina.

La secuencia codificante de la trombomodulina humana se ha caracterizado e identificado en Wen D.Z. et al. en 1987 (Biochemistr y , 1987, vol. 26, páginas 4350-7) descrito en EMBL con la referencia BC 035602 y Weiler H. et al. (J. Thromb. Haemost. 2003 Jul, 1 (7) : 151-24) .

La TM está presente en la superficie de todos los vasos sanguíneos (arterias, venas, capilares) y linfáticos del organismo, siendo en particular abundante en órganos muy vascularizados, como la placenta y el pulmón. Los queratinocitos, osteoblastos, células mesangiales, plaquetas y neutrófilos también la expresan.

La regulación de la síntesis de la TM depende principalmente del AMPcíclico, del TNFa, de la IL-1, y del ácido retinoico.

Las células endoteliales no secretan TM y no se degrada por la trombina. Únicamente bajo el efecto de diferentes tipos de agresiones de la célula endotelial (elastasa de polinucleares; citoquinas, macrófagos, lipopolisacáridos…) la TM endotelial se escinde en fragmentos que se liberan a la circulación en forma soluble y después se eliminan por vía renal. Una vez escindida, la TM celular es una forma soluble, es decir, plasmática, de TM, deleccionada de las regiones citoplasmáticas y membranosas (Ishiih et al., 1985. J.Clin.Invest. 76, 2178) . La evaluación de la TM plasmática soluble (TMp) constituye un buen marcador de lesión endotelial.

La función principal de la TM es la de oponerse a la acción procoagulante de la trombina, mediante diferentes mecanismos. Cuando la trombina (Th) se une a la TM sufre una modificación conformacional. Pierde sus propiedades coagulantes y su afinidad por las plaquetas y por el fibrinógeno. Sin embargo, siempre puede inactivarse por la antitrombina III (ATIII) . La formación del complejo TM-Th aumenta en presencia de sulfato de condroitina. Estas interacciones permiten a la TM eliminar del plasma la Th circulante. Este complejo TM-Th es capaz de activar la proteína C que, en presencia de la proteína S, inhibe los factores Va y VIIIa; esta sucesión de interacciones y de reacciones constituye el sistema de la proteína C. El complejo TM-Th también desempeña un papel en la activación de la proteína C ligada al receptor endotelial de la proteína C (EPCR) así como en la activación de una procarboxipeptidasa plasmática implicada en la fibrinólisis: el TAFI (inhibidor de la fibrinólisis activado por la trombina) . Por tanto, la TM posee una actividad antitrombótica en presencia de ATIII. Igualmente se atribuye a la TM un papel en la inflamación y en la proliferación/diferenciación celular (Figura 2)

La trombomodulina actúa por tanto como un inhibidor de la coagulación, en particular, acelerando la activación de la proteína C en proteína C activada (PCa) que por sí misma, en presencia del cofactor proteína S, inactiva los factores de la coagulación Va y VIIIa.

La síntesis in vivo de la trombomodulina está aumentada por diferentes factores, tales como el AMPc, los retinoides, las hormonas tiroideas, y la hipertermia (Conway E.M. et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 22804) . Otros agentes tales como las citoquinas, IL1, TNF, LPS, y la homocisteína, así como microorganismos intracelulares (citomegalovirus, Herpes, rickettsias) influyen negativamente sobre su expresión y su actividad, lo que conduce a un aumento transitorio de la actividad procoagulante de las células endoteliales.

Aunque las tasas de TM soluble (TMs) sean elevadas en los recién nacidos, la edad no influye en los sujetos sanos en una franja de edad considerada entre 20 y 60 años, no obstante el sexo del individuo sí que influye, puesto que se observan valores significativamente más elevados en el hombre que en la mujer.

En numerosas patologías, tales como CIVD, diabetes, leucemia mieloide crónica, insuficiencia hepática y renal, e igualmente en preeclampsias, púrpura trombótica trombocitopénica, rickettsiosis, enfermedad de Behcet, homocistinuria, se ha descrito una elevación de la tasa de TMs asociada a una agresión del endotelio. Se han observado tasas disminuidas en estudios de enfermedades con hipertensión arterial pulmonar y durante melanomas. Por último, se han descrito mutaciones del gen de la TM y se han asociado a una disminución de la tasa de TMs.

En el plano terapéutico, la perfusión del animal con TM recombinante ha demostrado su eficacia para prevenir la aparición de trombosis.

Teniendo en cuenta su influencia directa sobre las etapas de la coagulación, en particular en la activación del sistema de la proteína C, parece interesante poder determinar la actividad funcional de la trombomodulina.

En el estado de la técnica anterior ya se han propuesto ensayos de determinación de la actividad de la trombomodulina, sin embargo no conducen a la determinación de la actividad de la trombomodulina en los sistemasplasmáticos sino únicamente en los celulares. Recientemente, Öhlin A. K. et al. (Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2005, 3: 976-982) han descrito un método de evaluación en un medio plasmático. Sin embargo, esta publicación no propone un ensayo directo de la TMs sino que requiere una primera etapa de aislamiento y de separación por anticuerpos monoclonales dirigidos contra la trombomodulina plasmática. De hecho, en una primera etapa del ensayo descrito por Öhlin A. K. et al., el plasma ensayado, eventualmente diluido, se incuba en una microplaca cuyos pocillos contienen un anticuerpo monoclonal contra la trombomodulina humana. Tras haber retirado el plasma, los pocillos de las microplacas se lavan para conservar solo los fragmentos de trombomodulina que se han unido al anticuerpo. En una segunda etapa, los pocillos de la microplaca preparados de este modo se ponen en presencia de reactivos necesarios para obtener la proteína C activada. Tras la incubación, un sustrato cromogénico o fluorométrico permite revelar la proteína C activada.

Los autores de la publicación llegan a la conclusión de que sería importante en el futuro, diseñar un ensayo que permita medir directamente en el plasma la actividad de la trombomodulina sin pasar por una etapa de aislamiento y separación de la trombomodulina.

Por tanto, actualmente, la evaluación de la trombomodulina plasmática se basa únicamente en una evaluación antigénica de la proteína soluble que corresponde a la proteína de la membrana escindida que ha perdido la región citoplasmática carboxiterminal y la región transmembrana hidrófoba. La TMs es capaz de unirse a la trombina y de activar la proteína C, funciones localizadas en los motivos repetitivos del EGF.

Actualmente se dispone de diversos ensayos que aplican reacciones inmunológicas entre anticuerpos antitrombomodulina y la trombomodulina soluble.... [Seguir leyendo]

1. Un método de medición in vitro de la actividad funcional de la trombomodulina, comprendiendo dicho método evaluar, en un medio biológico, a partir de una muestra biológica, la activación de la proteína C en proteína C

activada (PCa) por la trombina en presencia de su cofactor, dicha trombomodulina, comprendiendo dicho método la adición, al plasma de la muestra, de agentes necesarios para la activación del sistema de la proteína C, la adición de proteína C purificada y también la adición de un inhibidor de la polimerización de la fibrina.

2. El método de medición in vitro de la actividad funcional de la trombomodulina según la reivindicación 1, 10 caracterizado por que la trombomodulina evaluada es la trombomodulina plasmática, siendo la muestra biológica una muestra de plasma, realizándose la evaluación en un medio plasmático.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que, para activar el sistema de la proteína C, se añade trombina e iones de calcio. 1.

4. El método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la actividad de la proteína C activada se determina usando un sustrato enzimático.

5. El método según la reivindicación 4, caracterizado por que se evalúa: 20

- la actividad amidolítica de la proteína C activada, usando un sustrato cromogénico o fluorométrico de la PCa, o

- una proteína plasmática de la coagulación cuya inhibición depende de la PCa, por ejemplo el factor Va, el factor VIIa, o

- el TAFIa o un sustrato del TAFIa. 25

6. El método según la reivindicación 5, caracterizado por que, cuando se mide la actividad amidolítica de la proteína C activada, se evalúa la liberación de la paranitroanilina mediante el sustrato sintético CBS 42.46.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, que comprende las etapas de: 30

a) poner en contacto una muestra de plasma con un reactivo 1 que comprende trombina, contenida en un medio que permite la activación del sistema de la proteína C, que comprende, en particular, iones de calcio, comprendiendo adicionalmente el reactivo 1 un inhibidor de la polimerización de la fibrina;

b) incubar el medio constituido en la etapa a) con un reactivo 2, que comprende la proteína C purificada, durante 35 un periodo de tiempo suficiente para permitir su activación en PCa por la trombina que forma un complejo con su cofactor, la trombomodulina contenida en la muestra de plasma;

c) poner en contacto el medio constituido en la etapa b) que comprende la proteína C activada, con un sustrato enzimático de la PCa; d) detectar la transformación del sustrato de la PCa y;

e) opcionalmente, evaluar adicionalmente un control interno.

8. El método según una de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado por que la muestra de plasma está diluida, por ejemplo, diluida a 1/3.

4.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que el inhibidor de la polimerización de la fibrina es un inhibidor polipeptídico, por ejemplo el H-GlyProArgPro-OH.AcOH (GPRP.AcOH) o es un anticuerpo antifibrinógeno.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado por que el tampón de trombina 50 comprende esencialmente los siguientes compuestos:

NaCl (0, 15 mmol/l) , Tris (20 mmol/l) , CaCl2 (2, 5 mmol/l) , BSA (5 mg/ml) y, cuando la muestra de plasma es característica de un paciente tratado con heparina, un inhibidor de heparina, por ejemplo polibreno (10 g/l) .

5.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado por que el sustrato enzimático de la proteína C activada es el oligopéptido THC-Pro-Arg-pNA.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones7 a 11 caracterizado por que la reacción se efectúa en las 60 siguientes condiciones:

- para la etapa a) , se ponen en contacto 70 μl de la muestra de plasma diluida a 1/3, con 40 μl de trombina 10 NIH diluida en un tampón que contiene NaCl (0, 15 mmol/l) , Tris (20 mmol/l) , CaCl2 (2, 5 mmol/l) , BSA (5 mg/ml) y en presencia del inhibidor de la polimerización de la fibrina, por ejemplo GPRP.AcOH (10 g/l) y, cuando la

muestra de plasma procede de un paciente tratado con heparina, un inhibidor de heparina, por ejemplo polibreno (10 g/l) ;

- para la etapa b) se incubaron 30 μl de proteína C durante 600 s con el medio constituido en la etapa a) ; -para la etapa c) 110 μl de sustrato enzimático de la proteína C activada, determinándose la cantidad de sustrato

enzimático transformado leyendo la densidad óptica dentro de un periodo de 6 a 500 s, a una longitud de onda 5 de 405 nm.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que la medición cuantitativa de la transformación del sustrato enzimático de la PCa se realiza leyendo la densidad óptica y los valores de densidad óptica obtenidos se comparan con una curva de calibración.

1.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado por que el reactivo 1 es la trombina contenida en un plasma deficiente en trombomodulina, al cual se añade un inhibidor de polimerización de fibrina y, cuando el plasma ensayado es característico de un paciente tratado con un anticoagulante, un inhibidor de dicho anticoagulante.

1.

15. Un kit para medir la actividad funcional de la trombomodulina en un medio biológico, especialmente un medio plasmático, que comprende:

- un reactivo 1 que comprende trombina diluida en un tampón que comprende un inhibidor de la polimerización 20 de la fibrina y calcio;

- un reactivo 2 que comprende la proteína C purificada;

- y si fuera apropiado, un reactivo 3 que comprende un sustrato enzimático de la proteína C activada y, opcionalmente

- un control interno y, opcionalment.

25. una curva de calibración de la actividad funcional de la trombomodulina

16. Un kit según la reivindicación 15, caracterizado por que el reactivo 1 comprende esencialmente los siguientes compuestos:

NaCl (0, 15 mmol/l) , Tris (20 mmol/l) , CaCl2 (2, 5 mmol/l) , BSA (5 mg/ml) y, cuando la muestra de plasma procede de un paciente tratado con heparina, un inhibidor de heparina, por ejemplo, polibreno (10 g/l) y un inhibidor de la polimerización de la fibrina, por ejemplo GPRP.AcOH utilizado a una concentración de 1 a 15 g/l.

17. Un kit para medir la actividad funcional de la trombomodulina, en un medio biológico, especialmente un medio 35 plasmático, que comprende:

- un reactivo 1 que comprende la trombina diluida en un tampón que comprende un inhibidor de la polimerización de la fibrina y calcio;

- un reactivo 2 que comprende TAFI y, si fuera apropiad.

40. un reactivo 3 que comprende un sustrato de TAFIa y, opcionalmente

- un control interno, y opcionalmente

- una curva de calibración de la actividad funcional de la trombomodulina.

18. Un método para la detección in vitro de una anomalía de coagulación, que comprende medir la actividad 45 funcional de la trombomodulina plasmática según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14.

19. El método según la reivindicación 18, que comprende comparar el nivel de actividad funcional medido de la trombomodulina, con un valor normal de dicha actividad obtenido después de evaluar la actividad funcional de la trombomodulina de un grupo de muestras de plasma normales, o establecido a partir de valores de la actividad

funcional de la trombomodulina medidos en muestras de plasma normales evaluadas individualmente.

20. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 18-19, o un kit según cualquiera de las reivindicaciones15 a 17 para la detección de:

- un aumento de la tasa de trombomodulina asociado a síntomas de coagulación intravascular diseminada (CIVD) , diabetes, leucemia mieloide crónica, insuficiencia hepática y renal, preeclampsia, púrpura trombótica trombocitopénica, rickettsiosis, enfermedad de Behcet, homocistinuria, aborto espontáneo, o

- una disminución de la tasa de trombomodulina asociada a síntomas de hipertensión arterial pulmonar o de

melanomas, .

60. una disminución de la tasa de trombomodulina asociada a una mutación en el gen de la trombomodulina.