Método de expresión de un gen en aves transgénicas usando vector de retrovirus y aves transgénicas así obtenidas.

Ave quimérica transgénica G0 en la que se introduce un gen de anticuerpo exógeno con un vector de retrovirusde replicación defectuosa,

y produce un anticuerpo derivado del transgén en al menos una de sangre, clara dehuevo y yema de huevo, en la que el contenido de dicho anticuerpo no es inferior a 20 μg/ml en sangre, o noinferior a 5 μg/ml en clara de huevo.

Método de expresión de un gen en aves transgénicas usando vector de retrovirus y aves transgénicas así obtenidas

Campo técnico La presente invención se refiere a un ave quimérica transgénica G0 que produce un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo scFv-Fc, en sangre y huevos. Además, la invención se refiere a un método de producción de un anticuerpo que comprende producir un ave quimérica transgénica G0 en la que se introduce un gen de anticuerpo exógeno con un vector de retrovirus de replicación defectuosa, y recuperar un anticuerpo producido en sangre, clara de huevo o yema de huevo. Además, la presente invención también se refiere a un método de producción de un ave quimérica transgénica G0 que expresa eficazmente un transgén, y al ave quimérica transgénica G0 que puede obtenerse mediante dicho método de producción.

Antecedentes de la técnica Como medio de investigación de las funciones de genes, se han realizado activamente investigaciones sobre animales transgénicos en los que se incorpora un gen exógeno en el huésped. Estos animales transgénicos son útiles no sólo en investigación fundamental, sino también en aplicaciones industriales tales como mejora de razas, producción de sustancias y donantes para órganos de sustitución. Un intento de hacer que la leche de vacas, cabras, ovejas, etc. produzca una sustancia biológicamente activa se ha aproximado a un uso práctico. Como ejemplos típicos del mismo, a1-antitripsina y antitrombina están ahora en fase clínica con el objetivo de lograr aplicaciones en productos farmacéuticos.

Las aves de corral, normalmente codornices y pollos, se han criado desde hace mucho tiempo para obtener carne y los huevos que ponen, por tanto también son presumibles diversos enfoques referentes a la mejora de razas tales como tolerancia a enfermedades y mejoras en la carne con el objetivo de investigación transgénica. Además, puesto que las aves requieren un corto periodo para alcanzar la madurez sexual y pueden criarse en espacios pequeños, se cree que son sistemas de expresión de proteínas de bajo coste y se espera que su producción transgénica sea un medio de producción de productos farmacéuticos de anticuerpos y proteínas raras. Puesto que los huevos de las aves contienen una gran cantidad de proteína y se ponen cada día, se cree que pueden convertirse en un sistema de producción eficaz si un producto transgénico puede producirse sistemáticamente como una proteína recombinante en huevos.

En cuanto a los anticuerpos monoclonales, que se han comercializado en muchos artículos y han atraído atención como productos farmacéuticos en los últimos años, la difusión en el mercado de los mismos se ha visto impedida puesto que no pueden producirse en un sistema de expresión barato tal como Escherichia coli, y el valor unitario de los mismos es caro. Mientras tanto, las células de aves tienen funciones para constituir una proteína de anticuerpo, y puede esperarse que aves transgénicas sean medios de producción de un anticuerpo para aplicaciones médicas, etc., que han sido convencionalmente difíciles de producirse en masa. Además, se cree que estos productos de proteína tienen una alta posibilidad de tener características ventajosas para aplicaciones en medicina y como agente de pruebas tales como estabilidad mejorada en sangre ya que las células de aves les proporcionan una cadena de azúcar.

Tal como se describió anteriormente, se espera que aves transgénicas sean útiles para aplicaciones tales como medios de producción de proteínas útiles, aunque por otro lado, independientemente de los diversos intentos que se han realizado hasta la fecha, no se ha encontrado aún ningún caso en el que se acumule de manera satisfactoria una proteína recombinante prevista en un huevo de ave a un nivel práctico. Además, no se ha encontrado aún ningún caso en el que se produzcan satisfactoriamente aves transgénicas que expresan una proteína que tiene una conformación que comprende una pluralidad de unidades tal como un anticuerpo a alta concentración.

Harvey et al. (Harvey, A. J et al. (2002) Nature Biotechnology. 19, 396) produjeron un pollo quimérico transgénico G0 usando un vector derivado del virus de la leucosis aviar e introduciendo el gen de 1-lactamasa en un pollo, pero la cantidad de expresión de enzima en suero o huevo era como máximo de aproximadamente 50 a 250 ng/ml. Pollos quiméricos transgénicos G1 a G3 producidos apareando los pollos quiméricos transgénicos G0 aumentaron la cantidad de expresión de enzima introduciendo genes en células somáticas completas, pero el aumento del nivel sigue siendo de como máximo varios !g/ml, por tanto están lejos todavía de una aplicación práctica.

Generalmente, para producir un animal transgénico, se usa un método que comprende microinyectar ADN en un pronúcleo de un huevo fértil, pero este método no puede aplicarse a aves. Esto se debe a que es difícil obtener un embrión en la fase de una célula, e incluso si puede obtenerse, no existe tecnología para distinguir el núcleo en el huevo. Para obtener el embrión en la fase de una célula, es necesario obtener un huevo inmediatamente tras la fertilización a partir de un oviducto de un ave hembra, y desarrollar el huevo de manera normal. En los últimos años, Perr y estableció un sistema para obtener una célula preescindida de gallina y cultivar la célula fuera del cuerpo (Perr y , M. M (1988) Nature, 331) . Sin embargo, incluso con esta tecnología, es imposible distinguir el núcleo dentro del huevo e introducir un gen previsto en el núcleo.

Por tanto, la introducción de un gen en un huevo fértil de ave se ha restringido a la inyección de ADN en el citoplasma, y se han intentado el uso de una bicapa lipídica con inclusión de ADN (liposoma) , un método de fosfato de calcio o un método de electroporación. Sin embargo, con estas tecnologías, la introducción eficaz del gen es escasa, y la posibilidad de que el ADN de plásmido introducido se introduzca en un cromosoma es baja. Aunque el método de introducción del gen mediante microinyección puede transferir eficazmente un ADN previsto a un huevo fértil, puesto que el ADN de plásmido introducido no se incorpora en un cromosoma del huésped, el plásmido del transgén se omite acompañado por la división de células somáticas del huésped, por tanto, no puede obtenerse el efecto de introducción estable del gen.

En 1986, se notificó por primera vez un ejemplo de producción de un pollo transgénico usando un vector de retrovirus (Salter, D. W et al. (1986) Poultr y Sci., 65) . La tecnología de inyección de un vector de retrovirus en un huevo fértil mediante el método de microinyección es una tecnología altamente eficaz en la introducción del gen, y para las aves a las que no puede inyectarse ADN directamente en el núcleo, es el único método práctico para producir animales transgénicos en los que se inserta un gen previsto en el cromosoma.

Los presentes inventores han realizado investigaciones intensas y, como resultado, encontraron un método de producción de un ave transgénica que comprende usar un vector de virus de replicación defectuosa seguro que se aplica también para terapia génica, e introducir eficazmente un gen previsto (publicación denominada “kokai” de solicitud de patente japonesa 2002-176880) . Mediante este método, se hizo posible producir de manera segura y eficaz un ave transgénica que tenía una pluralidad de copias del transgén. Además, también se encontró que el transgén se transmite a la siguiente generación con alta eficacia mediante esta tecnología, y el uso de un ave transgénica como sistema de producción de sustancias se ha aproximado a un uso práctico.

Sin embargo, puesto que la mayoría de los genes introducidos en este momento se inactivan por el huésped (denominado silenciamiento génico) en la fase temprana de desarrollo, la cantidad de producción de proteína como resultado de expresión génica era muy pequeña. Aunque el mecanismo biológico de la inactivación de transgenes no se ha clarificado aún, es indispensable una tecnología de prevención de esta inactivación y de expresión eficaz de un gen previsto para la aplicación de desarrollo de un ave transgénica.

Sumario de la invención Para especificar el momento del gen, que se ha introducido en un huevo fértil usando un vector de retrovirus, que se inactiva tras la generación, los presentes inventores estudiaron cómo cambia la cantidad de expresión introduciendo un vector en diversas fases tras la fertilización usando un gen de expresión de 1-galactosidasa como indicador. Como resultado, encontraron que la cantidad de expresión del transgén cambia significativamente dependiendo del momento... [Seguir leyendo]

1. Ave quimérica transgénica G0 en la que se introduce un gen de anticuerpo exógeno con un vector de retrovirus de replicación defectuosa, y produce un anticuerpo derivado del transgén en al menos una de sangre, clara de huevo y yema de huevo, en la que el contenido de dicho anticuerpo no es inferior a 20 !g/ml en sangre, o no inferior a 5 !g/ml en clara de huevo.

2. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 1, en la que una clase de una región constante del anticuerpo es IgG humana.

3. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 1, en la que una subclase de una región constante del anticuerpo es IgG1 humana.

4. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 1, en la que la región constante del anticuerpo es IgG de codorniz, IgG de pollo o IgG de ratón.

5. Ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el gen del anticuerpo está controlado por un promotor constitutivo.

6. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 5, en la que el promotor constitutivo es el promotor de beta-actina de pollo.

7. Ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el vector de retrovirus es un vector derivado del virus de la leucemia murina de Moloney.

8. Ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el vector de retrovirus es un vector de pseudotipo VSV-G.

9. Ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, siendo el ave un pollo o una codorniz.

10. Ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

11. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 10, que contiene no menos de 0, 1 !g/ml del anticuerpo en yema de huevo.

12. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 11, que contiene no menos de 1 !g/ml del anticuerpo en yema de huevo.

13. Ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el anticuerpo es un anticuerpo scFv-Fc.

14. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 13, que contiene no menos de 20 !g/ml del anticuerpo en sangre.

15. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 14, que contiene no menos de 2000 !g/ml del anticuerpo en sangre.

16. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 13, que contiene no menos de 5 !g/ml del anticuerpo en clara de huevo.

17. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 16, que contiene no menos de 500 !g/ml del anticuerpo en clara de huevo.

18. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 13, que contiene no menos de 5 !g/ml del anticuerpo en yema de huevo.

19. Ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 18, que contiene no menos de 500 !g/ml del anticuerpo en yema de huevo.

20. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 que comprende incubar un huevo fértil de ave, infectar un embrión temprano tras el transcurso de 24 horas o más desde el inicio de la incubación con un vector de retrovirus de replicación defectuosa, y entonces hacer eclosionar el embrión,

en el que una secuencia génica que codifica para un gen de anticuerpo está contenida en un transgén incorporado en un vector de retrovirus de replicación defectuosa.

21. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 20, que comprende incubar un huevo fértil de ave, en el que se microinyecta un vector de retrovirus de replicación defectuosa en el corazón

o un vaso sanguíneo formado en el embrión temprano.

22. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 20, que comprende incubar un huevo fértil de ave, en el que se microinyecta un vector de retrovirus de replicación defectuosa en el corazón o un vaso sanguíneo formado en el embrión temprano formado tras el transcurso de 24 horas o más desde el inicio de la incubación.

23. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en la que se microinyecta un vector de retrovirus de replicación defectuosa que tiene el título de no menos de 1 x 107 ufc/ml.

24. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 23, en la que se microinyecta un vector de retrovirus de replicación defectuosa que tiene el título de no menos de 1 x 108 ufc/ml.

25. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 24, en la que se microinyecta un vector de retrovirus de replicación defectuosa que tiene el título de no menos de 1 x 109 ufc/ml.

26. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en el que el vector de retrovirus es un vector derivado del virus de la leucemia murina de Moloney.

27. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, en el que el vector de retrovirus es un vector de pseudotipo VSV-G.

28. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, en el que el ave es un pollo o una codorniz.

29. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según las reivindicaciones 20 a 28, en el que la secuencia génica que codifica para un gen de anticuerpo está controlada por el promotor de beta-actina de pollo.

30. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según las reivindicaciones 20 a 29, en el que el gen del anticuerpo es un gen de anticuerpo quimérico.

31. Método de producción de un ave quimérica transgénica G0 según las reivindicaciones 20 a 30, en el que el gen del anticuerpo es un gen de anticuerpo scFv-Fc.

32. Método de producción de un anticuerpo que comprende producir el ave quimérica transgénica G0 mediante el método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 31, y recuperar el anticuerpo de la sangre y/o un huevo de dicha ave quimérica transgénica G0.

33. Ave quimérica transgénica G0 que se produce mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 31, en la que el contenido de una proteína derivada del transgén no es inferior a 20 !g/ml en sangre, o no inferior a 5 !g/ml en clara de huevo.

34. Método de producción de un ave transgénica, que comprende aparear el ave quimérica transgénica G0 según la reivindicación 33 con un ave alogénica para el tipo sexual, y entonces hacer eclosionar el huevo.

35. Método de producción de un ave transgénica según la reivindicación 34, en el que el ave alogénica para el tipo sexual es el ave transgénica G0 según la reivindicación 33 o una progenie de la misma.

36. Método de producción de un ave transgénica, que comprende aparear adicionalmente el ave transgénica G1 que se obtiene mediante el método según la reivindicación 34, y entonces hacer eclosionar el huevo.

37. Ave transgénica o una progenie de la misma, que puede obtenerse mediante el método según las reivindicaciones 34 a 36, en la que el contenido del anticuerpo no es inferior a 20 !g/ml en sangre, o no inferior a 5 !g/ml en clara de huevo.

38. Ave transgénica según la reivindicación 37, que es un ave transgénica G1, en la que el ave alogénica para el tipo sexual es el ave transgénica G0 según la reivindicación 33 o una progenie de la misma.

39. Método de producción de una proteína, que comprende extraer la proteína objetivo de una célula somática, sangre o un huevo del ave transgénica producida mediante el método según las reivindicaciones 34 a 36.

40. Huevo puesto por el ave transgénica según las reivindicaciones 37 ó 38, que contiene no menos de 1 mg de 5 una proteína heterogénea derivada de un transgén.

41. Huevo según la reivindicación 40, que contiene no menos de 20 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgén.

42. Huevo según la reivindicación 41, que contiene no menos de 100 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgén.

43. Huevo según la reivindicación 42, que contiene no menos de 200 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgén.