Medicamento principalmente anti-canceroso, destinado a los tratamientos por inmunoterapia, en particular autólogos.

Procedimiento de preparación de antígenos tumorales, preferentemente de proteínas tumorales y de forma más preferente aún de proteínas tumorales autólogas,

destinado a ponerlas en una forma reconocible por el sistema inmunitario caracterizado por que consiste esencialmente en:

a. aplicar un extracto tumoral,

b. poner en contacto este extracto tumoral con un soporte mineral en forma de partículas biocompatible sólido, preferentemente en polvo, apto para adsorber selectivamente los antígenos tumorales pretendidos y vectorizarlos in vivo a título de sustancias activas sobre el sistema inmunitario,

c. hacerlo de manera que el soporte mineral en forma de partículas adsorba selectivamente los antígenos tumorales de interés,

d. separar el soporte mineral del extracto tumoral no adsorbido,

e. recoger los antígenos tumorales de interés en forma purificada y adsorbida sobre el soporte mineral en forma de partículas

Medicamento principalmente anti-canceroso, destinado a los tratamientos por inmunoterapia, en particular autólogos.

Campo de aplicación:

El dominio de la invención es el de los tratamientos por inmunoterapia, en particular los tratamientos de cánceres, de enfermedades infecciosas o de enfermedades auto-inmunes y de los medios asociados a éstos.

Más precisamente, la invención se refiere a los tratamientos autólogos por inmunoestimulación.

Más precisamente aún, la invención se refiere a medios de lucha principalmente contra el cáncer, que comprenden vacunas anti-tumorales obtenidas a partir de antígenos tumorales de los pacientes.

La presente invención pretende principalmente un medicamento, por ejemplo una vacuna antitumoral, a base de micropartículas minerales (por ejemplo, hidroxiapatito) o poliméricas, biocompatibles.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de preparación de antígenos tumorales destinado a ponerlos en una forma reconocible por el sistema inmunitario y más particularmente para purificar los antígenos tumorales de un paciente determinado con el fin de realizar una autovacunación que genera una respuesta inmunitaria específica contra las células tumorales del paciente.

Estado de la técnica:

Las formas de tratamiento contra el cáncer por inmunoterapia son actualmente de tres tipos:

I. Administración de sustancias farmacológicas que aumentan la respuesta inmunitaria de manera no específica. Puede tratarse por ejemplo de la administración de interleuquinas o de interferón a los pacientes que tienen un tumor maligno renal o bien un melanoma. Otra terapia no específica es la administración de BCG a los pacientes que tienen un cáncer de vejiga. Estas terapias tienen un grado variable de toxicidad y aunque puedan mostrar una determinada eficacia, muchos de los pacientes así tratados responden débilmente. Estas terapias provocan una amplificación de numerosas funciones inmunitarias.

II. Utilización de anticuerpos específicos contra los antígenos tumorales presentes en la superficie de las células tumorales. Uno de los ejemplos es la administración de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la oncoproteína HER-2/neu. Esta oncoproteína se expresa en un porcentaje bajo (20-30%) de los pacientes que tienen un cáncer de mama. El anticuerpo monoclonal se ha modificado por ingeniería genética para que solamente una pequeña parte de la molécula sea de origen no humano (la parte que reconoce el antígeno es producida por la rata) , el resto de la molécula es de origen humano. De hecho, es un anticuerpo híbrido humanizado. Se han preparado diversos anticuerpos híbridos que se han evaluado y algunos de ellos se utilizan clínicamente en el tratamiento de diversos tipos de tumores malignos. La unión de los anticuerpos a su antígeno específico lleva a la célula tumoral a ralentizar su proliferación y a la muerte. Aunque estos tratamientos sean un avance significativo, su eficacia está limitada por la variabilidad antigénica de las células tumorales. En un tumor sólido, en el momento del diagnóstico, existen millones de células tumorales y entre esta población, existen determinadas células que expresan los antígenos de interés y otras que no.

III. Estimulación de las células T. Esta forma de terapia está relacionada con el objeto de la invención.

El tipo III comprende la inmunoterapia adoptiva, denominada así porque es adoptada por el paciente. No es innata, se desarrolla lejos del paciente (ex vivo) , con el objetivo de aumentar el número de células T antitumorales. Esto se obtiene administrando al paciente células T citotóxicas que se han generado y amplificado in vitro.

El tipo III engloba igualmente la inmunoterapia activa basada en la estimulación de las células T. Esto se produce gracias a la puesta en contacto de los antígenos tumorales con los macrófagos o células emparentadas (como por ejemplo las células dendríticas de la piel: las células de Langerhans) , que presentan los antígenos con el fin de que estas células denominadas APC (Antigen Presenting Cells: células presentadoras del antígeno) estimulen los linfocitos T. Esta estrategia puede hacerse in vivo o in vitro. Estas células APC inician, más que mantienen la inmunidad antitumoral específica obtenida de los linfocitos T. La inmunoterapia activa es el objeto de numerosas investigaciones para diversos tumores.

Estos agentes que estimulan los linfocitos T son asimilables a las vacunas. Así, existen varias estrategias A/, B/, C/, D/ para generar vacunas que estimulan el sistema T de forma activa y específica:

A/ Estrategia de inmunoterapia que se basa en el empleo de células dendríticas y otras células (in vitro) . Cuando éstas están en fase de crecimiento, se ponen en contacto, fuera del organismo, con los antígenos tumorales del paciente (lisado tumoral autólogo, células tumorales irradiadas, péptidos tumorales específicos) y se inyectan intradérmicamente al mismo paciente (el resto se crioconserva para otras inyecciones) .

B/ Estrategia de inmunoterapia que se basa en el empleo de antígenos específicos y de moléculas estimulantes. Los antígenos tumorales específicos que pueden utilizarse en las vacunas son numerosos, por ejemplo péptidos producidos de genes mutados como ras, p53, VHL, que están asociados con adyuvantes tales como Montanida ISA

51. Se pueden utilizar igualmente péptidos sintéticos o recombinantes solubles de fracciones de antígenos tumorales específicos como MART-1 (melanomas) o PSA (próstata) .

C/ Estrategia de inmunoterapia que se basa en el empleo de células tumorales o de un lisado de células tumorales. Las células tumorales utilizadas en esta estrategia pueden ser células autólogas o alogénicas inactivadas de diversas maneras (radiación, congelación, calor, luz ultravioleta) o bien lisados de células tumorales (las células se homogeneizan) .

D/ Estrategia de inmunoterapia que se basa en el empleo de proteínas de choque térmico como adyuvante:

En este caso, se extraen del tumor las proteínas de choque térmico (HSP) como gp 96 o HSP 70. Estas proteínas actúan como chaperones moleculares, y transportan péptidos (antígenos) específicos del tumor de cada paciente.

La capacidad de las HSP de unirse a casi todo el proteoma celular hace que estas moléculas sean una buena opción como vacunación antitumoral por tres razones principales:

No es útil conocer todo el proteoma tumoral porque la purificación sólo de las HSP permite aislar un gran número de proteínas que están unidas a ellas Su inyección permite de una sola vez la introducción en el organismo de una gran cantidad de proteínas tumorales en una forma reconocible por el sistema inmunitario.

Las HSP permiten la captación, el tránsito y el remodelado de las proteínas que están asociadas a ellas por las células presentadoras del antígeno con el fin de ser presentarlas a los linfocitos T.

Una de las características de la utilización de estas proteínas como vacuna antitumoral es la necesidad de utilizar las HSP que provienen del tumor a erradicar porque éstas constituyen una huella molecular de éste y es diferente entre pacientes y de un tumor a otro.

Esto impone purificar las proteínas vacunantes a partir de cada tumor contra el que éstas deben inmunizar al paciente. El protocolo de purificación es largo, difícilmente industrializable y está sujeto a múltiples contaminaciones por endotoxinas. Es clásico purificar las HSP a partir de un triturado tumoral que se somete a una serie de centrifugación, precipitación, cromatografía en Con A, análisis electroforético y cromatografía en Mono Q FPLC.

Las patentes US Nos 6.447.781, 6.436.404, 6.410.028, 6.383.494 y 6.030.618 describen métodos de purificación de proteínas HSP que consisten en aplicar columnas cromatográficas de Con A SEFAROSA. Estos métodos son perfectibles.

Por otra parte, se conocen métodos de purificación que recurren a los fosfatos de calcio y en particular al hidroxiapatito (HA) . Los polvos de hidroxiapatito se utilizan desde hace treinta años para purificar diversas moléculas biológicas como proteínas, ácidos nucleicos, endotoxinas e incluso virus. Los polvos se utilizan como lecho fijo en las columnas de cromatografía a través de los cuales se percola la disolución que contiene la o las moléculas a purificar. Estas moléculas se fijan en la superficie de las partículas de polvo, de la que se desadsorben mediante concentraciones de diversas disoluciones salinas tales como tampones fosfato o bien cloruro de sodio, lo que permite separar las diferentes moléculas de la disolución por gradientes de tampones... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de preparación de antígenos tumorales, preferentemente de proteínas tumorales y de forma más preferente aún de proteínas tumorales autólogas, destinado a ponerlas en una forma reconocible por el sistema inmunitario caracterizado por que consiste esencialmente en:

a. aplicar un extracto tumoral,

b. poner en contacto este extracto tumoral con un soporte mineral en forma de partículas biocompatible sólido, preferentemente en polvo, apto para adsorber selectivamente los antígenos tumorales pretendidos y vectorizarlos in vivo a título de sustancias activas sobre el sistema inmunitario,

c. hacerlo de manera que el soporte mineral en forma de partículas adsorba selectivamente los antígenos tumorales de interés,

d. separar el soporte mineral del extracto tumoral no adsorbido,

e. recoger los antígenos tumorales de interés en forma purificada y adsorbida sobre el soporte mineral en forma de partículas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el extracto tumoral aplicado en la etapa a. es un extracto tumoral autólogo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que comprende una etapa adicional de mezcla de los antígenos tumorales purificados y adsorbidos sobre el soporte con al menos un cofactor apto para promover la acción de los antígenos tumorales sobre el sistema inmunitario, obteniéndose preferentemente dicho cofactor de los extractos tumorales, principalmente de triturados, liofilizados, dializados o sedimento de centrifugación.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

a. preparación del extracto tumoral que permite la suspensión o solubilización de los antígenos tumorales de interés,

b. percolación de la suspensión o de la disolución a través de al menos una columna que contiene el soporte mineral en forma de partículas,

c. lavado de la columna con disoluciones tampón de fuerza iónica y pH determinados,

d. recogida del soporte que ha adsorbido los antígenos tumorales.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por que un primer lavado de la columna se efectúa con un tampón fosfato o una disolución de NaCl con una concentración inferior o igual a 200 mM y/o por que un segundo lavado se efectúa con un tampón fosfato o una disolución de NaCl con una concentración comprendida entre 300 a 500 mM.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado por que la preparación del extracto tumoral comprende las etapas siguientes:

a. eventualmente congelación del tejido tumoral,

b. trituración del tejido tumoral,

c. solubilización o suspensión de los antígenos tumorales en una disolución de NaHCO3,

d. centrifugación,

e. separación del sedimento y del sobrenadante.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el soporte mineral en forma de partículas se elige entre los materiales que presentan todas o parte de las propiedades siguientes:

presencia de al menos uno de los grupos ionizados o ionizables PO42-, OH- y/o Ca2+ en la superficie de dicho material, pH de superficie básico,

carga de superficie negativa, hidrófobo.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el soporte mineral en forma de partículas se elige:

en el grupo que comprende los minerales cálcicos, preferentemente los fosfatos de calcio y más preferentemente aún los hidroxiapatitos, o

entre las cerámicas, preferentemente una cerámica de fosfato de calcio, en particular un hidroxiapatito, un fosfato tri, tetra u octocálcico en forma de partículas.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los antígenos tumorales comprenden:

a. los antígenos cuya expresión está repartida en diferentes tipos histológicos de cánceres y más particularmente los antígenos MAGE (antígenos de melanoma) , BAGE (antígenos de vejiga) , GAGE (antígenos gástricos) , RAGE (antígenos renales) , -fetoproteína, MUCI, HER-2/neu y sus mezclas,

b. los antígenos codificados por genes mutados y más particularmente los genes Oncogenes ras, Genes supresores p53, -catenina, Cdk4, la fusión de los antígenos bcr/abl, productos de genes virales (Epstein Barr, hepatitis B, papiloma) , CASP-8 y sus mezclas,

c. los antígenos asociados a los tumores Antígeno carcino-embrionario, Antígeno prostático, RU2, Alt-M-CSF, Tirosinasa, Melan-A/MARTI, Gp100, Gp75, oncogén asociado a glioma, GLIP1 y/o d. las proteínas de choque térmico (HSP, Heat Shock Protein) , preferentemente la proteína gp96 y los péptidos asociados.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que después de la purificación y fijación sobre el soporte tal como se ha definido en las reivindicaciones 7 u 8, los antígenos tumorales se desadsorben en una disolución de NaCl o un tampón fosfato 500 mM que se diluye entre 100 y 200 mM y se vuelve a pasar sobre una columna que comprende un soporte tal como se ha definido en las reivindicaciones 7 u 8 de granulometría inferior a 10