Materiales y métodos relacionados con terapias basadas en células.

Población de células multipotentes aisladas producida mediante:

(a) proporcionar tejido de conducto pancreático de adulto que comprende conductos completos,

(b) triturar dicho tejido de conducto,

(c) cultivar dicho tejido triturado, y

(d) recoger una monocapa de población de células emergentes del cultivo de la etapa (c);población que:

(i) es positiva para GFAP y NCAM,

(ii) es negativa para PDX-1, y

(iii) comprende tanto células positivas para nestina como negativas para nestina tal como se determina medianteanálisis de citometría de flujo;

para uso en un método de estimulación de la regeneración de células beta pancreáticas del huésped en un sujetodiabético.

Materiales y métodos relacionados con terapias basadas en células

Campo de la invención La presente invención se refiere a la provisión de una terapia basada en células para la regeneración de tejido y el tratamiento del envejecimiento y estados patológicos asociados con la degeneración celular o cambios tisulares relacionados con la edad. Esta terapia presenta células de origen adulto que pueden usarse en trasplante. La invención se refiere además a preparaciones para uso en trasplante y la regeneración de tejido para paliar daño celular y orgánico, y todavía adicionalmente, a métodos de evaluación y a la idoneidad de agentes terapéuticos basados en células para trasplante.

Antecedentes de la invención Las células madre son células no especializadas que tienen la capacidad para proliferar durante largos periodos en cultivo y que pueden inducirse para convertirse en tipos de células especializadas. Pueden aislarse células madre principalmente del embrión o adulto aunque éstas parecen tener un carácter y función distintos.

Se han aislado células madre de los embriones (células madre embrionarias/del embrión, CME) de numerosas especies de mamíferos. Las procedentes del ratón han sido objeto de un intenso estudio durante los últimos veinte años y han allanado el terreno para el aislamiento de CME humanas que se han aislado y con las que se trabaja desde 1998 (1, 2) .

Las CME se derivan normalmente del blastocisto embrionario en el que, in vivo, continúan para dar lugar a tipos de células de desarrollo posteriores. Las células madre de adulto (CMA) por otra parte, están presentes en numerosos tejidos en los que permiten la sustitución de células perdidas por una agresión y, o, el deterioro natural.

Estas células tienen el potencial de proporcionar terapias de base celular para el tratamiento de enfermedades tales como diabetes y enfermedad de Parkinson, en las que existen daño y pérdida celular que conducen a la patología específica. También tienen un gran potencial para seleccionar fármacos, investigaciones toxocológicas, investigar programas de desarrollo, tratar la degeneración y pérdida de tejido relacionadas con la edad. También tienen un potencial para la regeneración de tejido tras extirpación quirúrgica, agresión o como parte de intervenciones de cirugía estética.

En la actualidad, sólo existen tratamientos limitados basados en terapias con células madre en uso clínico. Uno de los factores complejos que limitan el traslado de una terapia basada en células o terapia con CMA no hematopoyéticas de este tipo, es una incapacidad para controlar definitivamente la diferenciación de las células madre para generar un único tipo de célula y controlar el riesgo de neoplasia por el uso de una fuente de células de este tipo. La pertinencia de esto último con respecto a las CMA está sin determinar. No se dispone de datos de seguimiento a largo plazo para ningún trasplante de células madre no hematopoyéticas humanas.

Las células madre tienen tres propiedades generales que las distinguen de otras células en el organismo:

(i) No están especializadas y no tienen una función de desarrollo específica aparente.

(ii) Pueden producir autoproliferación durante largos periodos en cultivo, a diferencia de otros tipos de células primarias que experimentan senescencia o estasis. Las células madre, sin embargo, pueden autorrenovarse.

(iii) Pueden dar lugar a tipos de células especializadas con funciones específicas (por ejemplo; neuronas, células beta, cardiomiocitos) .

Las células madre embrionarias se derivan normalmente de la masa de células internas del blastocisto de embriones fertilizados, un grupo de aproximadamente 30 células en un extremo del blastocele. Esto ha conducido a un 55 importante debate ético y moral que rodea el uso de tales células derivadas de embriones humanos. Las CME se aíslan normalmente a través de la transferencia de la masa de células internas a medio de cultivo apropiado en presencia de una capa de alimentación de queratinocitos murinos. Se realizan pases en serie posteriormente del cultivo resultante durante varios meses para establecer una línea celular. Las CME así cultivadas, se consideran normalmente como una línea celular pluripotente tras seis meses o más en cultivo sin diferenciación No hay una prueba convencional definida existente para caracterizar células de manera inequívoca como CME. La caracterización típica se basa en un periodo prolongado de crecimiento no diferenciado en cultivo y la expresión de un marcador denominado Oct 4, en combinación con una variedad de marcadores de superficie (véase la tabla 1) que se requiere para el mantenimiento de características de autorrenovación. Esto se correlaciona con un análisis 65 de cariotipo para garantizar la integridad genética macroscópica de las células y una determinación de si las células pueden volver a cultivarse tras ciclos de congelación/descongelación.

Una correlación adicional es una determinación de pluripotencia in vitro y la capacidad para formar teratomas tras la inyección en un ratón inmunosuprimido. Los teratomas son tumores benignos que contienen de manera rutinaria múltiples tipos de células, demostrando por tanto que las CME pueden diferenciarse en múltiples tipos de células

(1, 2)

El control del crecimiento de CME no diferenciadas está bien establecido por los expertos en la técnica. Cuando, en condiciones de cultivo definidas, se permite que las CME formen cuerpos embrioides, se diferencian espontáneamente para formar múltiples tipos de células. Esto puede comprometer la producción de poblaciones puras de tipos de células definidos para terapias de base celular.

La diferenciación dirigida de las CME, utilizando el crecimiento en medios de cultivo específico, puede enriquecerse para tipos de células particulares. Se ilustran ejemplos en (3, 4) . Las poblaciones de células puras derivadas de este procedimiento son posibles terapias para diabetes, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, distrofia muscular de Duchenne, enfermedad cardiaca, ceguera y muchos otros estados.

Sin embargo, el sistema hematopoyético ha proporcionado un paradigma para las CMA. Basándose en esto, se cree que las CMA normalmente generan los tipos de células del tejido en que residen, aunque se ha mostrado que presentan plasticidad in vitro (5, 6) . Se ha demostrado que las células madre hematopoyéticas (CMH) , por ejemplo dan lugar a neuronas y cardiomiocitos y demuestran un injerto de múltiples órganos, múltiples linajes (7) . Esto hace que las CMA salgan de las dianas para terapias basadas en células. El término plasticidad, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una célula madre de un tejido para generar los tipos de células diferenciadas de otro tejido. Esto también se denomina “diferenciación heterodoxa” (8) o “transdiferenciación” (9, 10) en la bibliografía del campo.

Las CMA son células no diferenciadas que se encuentran entre células diferenciadas en un tejido u órgano de adulto, no están especializadas y pueden autorrenovarse por sí mismas y mantener una capacidad para diferenciarse, para producir los principales tipos de células de un tejido u órgano. Se considera que las CMA mantienen y efectúan la reparación de tejido. Se desconoce el origen de las células madre de adulto en tejidos maduros y aún está por determinar el grado de su plasticidad. Su uso en trasplante se conoce ampliamente. Se han usado CMA de médula ósea en trasplantes durante 30 años. El uso de CMH que no son de adulto, su eficacia, plasticidad y seguridad en el seguimiento a largo plazo sigue sin demostrarse. Los informes de CMA no estromales siguen debatiéndose en el campo, aunque las células madre neurales están ahora establecidas y aceptadas como un tipo de CMA de buena fe. Para una revisión detallada del campo, véase (6) .

Los números de las CMA en cualquier tejido parecen ser limitados. La caracterización de tales células es todavía imprecisa entre los expertos en la técnica. Normalmente, esto se logra a través de pruebas similares a las usadas para las CME, complementadas con estos ensayos. Éstos incluyen marcar las células en un tejido vivo con marcadores moleculares y luego determinar qué tipos de células generan (30) o tomar las células y marcarlas ex vivo, y seguir su destino tras el trasplante en un segundo animal. Alternativamente, las CMA pueden someterse a cultivo in vitro, para determinar qué tipos de células diferenciadas pueden dar lugar. El aislamiento clonal y la propagación de células individuales seguido por trasplante para la determinación del estado multipotencial... [Seguir leyendo]

1. Población de células multipotentes aisladas producida mediante: 5 (a) proporcionar tejido de conducto pancreático de adulto que comprende conductos completos,

(b) triturar dicho tejido de conducto,

(c) cultivar dicho tejido triturado, y 10

(d) recoger una monocapa de población de células emergentes del cultivo de la etapa (c) ;

población que: 15 (i) es positiva para GFAP y NCAM,

(ii) es negativa para PDX-1, y

(iii) comprende tanto células positivas para nestina como negativas para nestina tal como se determina mediante 20 análisis de citometría de flujo;

para uso en un método de estimulación de la regeneración de células beta pancreáticas del huésped en un sujeto diabético.

2. Población de células para uso según la reivindicación 1, en la que las células no son inmunogénicas.

3. Población de células para uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el método comprende el tratamiento de una enfermedad asociada con degeneración de las células pancreáticas.

4. Población de células para uso según la reivindicación 3, en la que la enfermedad se selecciona de diabetes tipo I y diabetes tipo II.

5. Población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el método comprende además la administración intravenosa de dicha población de células. 35

6. Población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la población de células y el sujeto son de la misma especie.

7. Población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el sujeto es 40 humano.

8. Población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que en la etapa (a) el tejido de conducto pancreático es tejido de conducto pancreático de adulto humano que comprende conductos completos.