Proteínas mutantes de neumolisina.

Una proteína neumolisina (PLY) mutante aislada,

en la que la proteína PLY mutante tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la proteína PLY nativa que tiene la secuencia mostrada en la figura 1 y difiere de dicha proteína PLY nativa en la presencia de una deleción de uno o más aminoácidos dentro de la región de aminoácidos 144 a 151 de la secuencia nativa,

de modo que la toxicidad del mutante se reduce en relación con la proteína nativa.

Proteínas mutantes de neumolisina.

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden proteínas neumolisina de Streptococcus pneumoniae mutantes. La invención además se refiere a dichas proteínas y a los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas.

Antecedentes de la invención [0002] Streptococcus pneumoniae es un patógeno importante, que produce enfermedades invasivas como neumonía, meningitis y bacteriemia. Incluso en regiones donde se dispone libremente de terapia antibiótica eficaz, la tasa de mortalidad debido a neumonía neumocócica puede ser de hasta el 19% en los pacientes hospitalizados. En países en vías de desarrollo, más de 3 millones de niños menores de 5 años mueren cada año de neumonía, de la cual S. pneumoniae es el agente causante más común. S. pneumoniae también produce infecciones menos graves pero de mayor prevalencia como otitis media y sinusitis, que tienen un impacto significativo sobre los costes de la atención sanitaria en los países desarrollados. La otitis media es especialmente importante en niños pequeños, mientras que la sinusitis afecta tanto a niños como a adultos.

La vacuna polisacárida conjugada heptavalente de Wyeth, comercializada como Prevnar® en Estados Unidos y como Prevenar® en el resto del mundo es, en la actualidad, la única vacuna conjugada eficaz disponible para la protección frente a la infección por Streptococcus pneumoniae (Kyaw y col., 2002; Hausdorff y col., 2000) . La vacuna contienen siete polisacáridos capsulares de Streptococcus purificados (serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) de entre los 90 posibles (Kalin, 1998) , conjugado cada uno a una proteína vehículo. La preparación de esta vacuna se describe en la patente de EE. UU. 4.673.574 (Anderson) . La proteína utilizada para la conjugación de los polisacáridos capsulares es un toxoide de difteria, el CRM197 que ofrece un aumento de la inmunogenicidad de las vacunas en los bebes (Blum y col., 2000; Katkocin, 2000) . Sin embargo, cada serotipo de S. pneumoniae tiene un polisacárido capsular estructuralmente diferente, de manera que la inmunización con un serotipo tiende a no conferir protección frente a la mayoría de los demás serotipos, aunque se produce cierta protección cruzada frente a los serotipos relacionados con la vacuna (Whitney y col., 2003) .

Se están estudiando técnicas complementarias a la inmunización específica de serotipo. Una posibilidad es utilizar también un factor de virulencia común a las especies como la neumolisina (PLY) , la toxina de 53 kDa producida por todas las cepas invasivas de S. pneumoniae (Paton y col., 1993) . PLY podría usarse sola o como proteína portadora conjugada a los polisacáridos en Prevnar®, ofreciendo un aumento de la eficacia. Alexander y col (1994) mostraron que la inmunización de ratones con un toxoide de PLY confería protección inmunitaria tras la estimulación con 9 serotipos diferentes de S. pneumoniae. Se ha demostrado que PLY estimula una respuesta inmunitaria similar a la de la infección por S. pneumoniae activando la ruta clásica del complemento (Paton y col., 1984) e induciendo apoptosis de neutrófilos y macrófagos (Cockeran y col., 2002; Kadioglu y col., 2000) .

PLY pertenece al grupo de citolisinas dependientes de colesterol (CDC) que se unen al colesterol de las membranas de la célula huésped antes de la formación de estructuras anulares de 30-50 mer grandes que crean poros líticos (Palmer, 2001; Jedrzejas, 2001) . El mecanismo de formación de poros no está completamente elucidado y existe un gran debate sobre la secuencia de acontecimientos (Bonev y col., 2000; Shepard y col., 1998) . Sin embargo, la capacidad para formar poros significa que la PLY nativa es altamente tóxica, lo cual es un problema en términos del desarrollo de composiciones inmunogénicas.

Aunque el proceso de conjugación utilizado en la producción podría dar lugar a una PLY no tóxica, podría ser más favorable empezar con una forma no tóxica. Adicionalmente, podría ser difícil utilizar una forma tóxica en la preparación de composiciones inmunogénicas no conjugadas. La toxicidad de PLY puede reducirse significativamente mediante una mutagénesis dirigida a sitio para crear toxoides de PLY, conocidos como neumolisoides (Paton, 1996) .

Existen diversos toxoides que se ha demostrado proporcionan protección inmunitaria, de forma independiente o conjugados con polisacáridos, a ratones en respuesta a una estimulación con S. pneumoniae D39 de tipo 2 virulento (Paton y col., 1991; Alexander y col., 1994) . La mayoría de las mutaciones se habían creado previamente en la región de 11 aminoácidos altamente conservada próxima al extremo C-terminal (Mitchell y col.; Berr y y col., 1995) . Se ha demostrado que este sitio está implicado en la unión a la célula huésped (de los Toyos y col., 1996) . Algunas de estas formas mutadas de PLY se describen en la solicitud de patente internacional WO 90/06951; cada una de las mutaciones descritas en esta publicación está dirigido hacia el extremo C-terminal de la proteína.

Un problema adicional con la PLY es que se agrega tras su producción a gran escala, problema que debe resolverse para poder utilizar PLY en composiciones inmunogénicas. Se considera que la agregación de PLY está relacionada con su oligomerización implicada en la formación de poros. La presente invención intenta reducir o eliminar la interacción PLY-PLY (oligomerización) , de modo que disminuirá la posibilidad de agregación durante la producción a gran escala, creando de este modo una forma de PLY que se purifica fácilmente.

Toyos y col. (1996) describen la aparición de anticuerpos monoclonales (AcM) frente a diversas regiones de PLY y su uso en el sondeo de la toxina completa y de una forma «proteinasa K mellada». La proteinasa K corta PLY en fragmentos de 37 kDa y 15 kDa. El anticuerpo AcM PLY 4 solo reconocer PLY completa y ninguno de los fragmentos, lo que indica que el epítope sobre PLY para este AcM está dentro de la región mellada. Cuando PLY se incubaba previamente con el AcM PLY4 y se añadía después a los liposomas, la toxina dejaba de formar poros en la membrana del liposoma. Esto supone que el sitio bloqueado por el AcM PLY 4 (que se piensa es la región de la asparragina N143) es el sitio responsable de la interacción con otros monómeros de PLY para formar poros oligoméricos. La oligomerización de la estreptolisina O a partir de Streptococcus sp. también puede bloquearse mediante AcM como demostraron Hugo y col en 1986. Se desconoce si los anticuerpos previenen directamente la oligomerización uniéndose a los sitios de oligomerización o si existe una asociación que entorpezca estéricamente la interacción de los monómeros de la toxina.

El anticuerpo monoclonal PLY 4 ha sido caracterizado adicionalmente por Suárez-Álvarez y col. (2003) y estos autores sugieren que el epítope para el AcM PLY 4 está más hacia el extremo 3’ que la región N143 inicialmente propuesta por Toyos y col. en 1996. Ahora el sitio de reconocimiento parece ser dependiente de conformación y está entre los aminoácidos E151-Y247 y no dentro de la región N143.

Previamente los presentes inventores crearon una deleción N142N143 y una sustitución N143D dentro de la PLY como pasos iniciales para entender esta región y su papel en la oligomerización. La caracterización de ambos mutantes mostró un comportamiento idéntico al de la PLY nativa en términos de hemólisis y formación de poros (Search, 2002) , lo que sugiere que la oligomerización no estaba bloqueada y la toxicidad de los mutantes permanecía sin cambios. Por tanto, las formas mutantes de PLY creadas previamente no mostraban reducción de la toxicidad o de la oligomerización, lo que sugiere que estas mutaciones no ayudarán a la producción de composiciones inmunogénicas.

Resumen de la invención [0012] La presente invención se refiere en líneas generales a composiciones inmunogénicas que comprenden proteínas neumolisina de Streptococcus pneumoniae mutantes. La invención además se refiere a dichas proteínas y a los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas.

La invención proporciona una proteína neumolisina (PLY) mutante aislada, donde la proteína PLY mutante tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la proteína PLY nativa que tiene la secuencia mostrada en la figura 1 y difiere de dicha proteína PLY nativa en la presencia de una deleción de uno o más aminoácidos en la región de aminoácidos 144 a 151 de la secuencia nativa, de modo que la toxicidad del mutante se reduce en relación con la proteína nativa.

Por ejemplo, la proteína PLY mutante puede diferir de la proteína nativa en la... [Seguir leyendo]

1. Una proteína neumolisina (PLY) mutante aislada,

en la que la proteína PLY mutante tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la proteína PLY nativa que tiene la secuencia mostrada en la figura 1 y difiere de dicha proteína PLY nativa en la presencia de una deleción de uno o más aminoácidos dentro de la región de aminoácidos 144 a 151 de la secuencia nativa, de modo que la toxicidad del mutante se reduce en relación con la proteína nativa.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que se elimina la alanina 146.

3. La proteína de la reivindicación 1, en la que la proteína PLY mutante difiere de la proteína nativa en la deleción de dos aminoácidos adyacentes dentro de la región de aminoácidos 144 a 151 de la secuencia nativa.

4. La proteína de la reivindicación 3, en la que se eliminan los aminoácidos valina 144 y prolina 145.

5. La proteína de la reivindicación 3, en la que se eliminan los aminoácidos alanina 146 y arginina 147.

6. La proteína de la reivindicación 3, en la que se eliminan los aminoácidos metionina 148 y glutamina

149.

7. La proteína de la reivindicación 3, en la que se eliminan los aminoácidos tirosina 150 y ácido glutámico 151.

8. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la proteína además comprende al menos una sustitución o deleción de aminoácido al menos en una de las regiones de aminoácido.

25. 297, 367397 .

42. 437 de la secuencia nativa.

9. Un conjugado inmunogénico que comprende: a) un sacárido, oligosacárido, polisacárido, péptido, polipéptido o proteína y b) una proteína neumolosina (PLY) mutante aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. El conjugado inmunogénico de la reivindicación 9, en el que el sacárido, oligosacárido o polisacárido deriva de Streptococcus pneumoniae.

11. Una secuencia de ácido nucleico aislada y purificada que comprende una secuencia de ácido nucleico a) que codifica una proteína neumolisina (PLY) mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o b) que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico definida en a) .

12. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada y purificada que comprende la secuencia de ácido nucleido de la reivindicación 11.

13. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 12.

14. Un procedimiento de producción de una proteína neumolisina (PLY) mutante aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende: a) transformar, transfectar o infectar una célula huésped con un vector de expresión recombinante como se describe en la reivindicación 12 y cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína PLY mutante por la célula huésped y b) recuperar la proteína PLY mutante a partir del cultivo.

15. Una composición inmunogénica que comprende: a) una proteína neumolisina (PLY) mutante aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y b) uno o más adyuvantes, diluyentes o vehículos fisiológicamente aceptables.

16. Una composición inmunogénica que comprende: a) un conjugado inmunogénico según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y b) uno o más adyuvantes, diluyentes o vehículos fisiológicamente aceptables.

17. Uso de una proteína PLY mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un conjugado inmunogénico según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 en la preparación de una composición inmunogénica

para la profilaxis o tratamiento de la infección por una bacteria que tiene una citolisina dependiente de colesterol que presenta reactividad inmunológica cruzada con la neumolisina nativa.

18. Uso según la reivindicación 17 en la que dicha infección bacteriana es infección por Streptococcus, p. ej., infección por Streptococcus pneumoniae.

19. Una proteína PLY mutante aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un conjugado inmunogénico según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 para su uso en un procedimiento de tratamiento médico.

20. Una proteína PLY mutante aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un conjugado inmunogénico según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 para su uso en un procedimiento de profilaxis o tratamiento de la infección por una bacteria que tiene una citolisina dependiente de colesterol que presenta reactividad cruzada inmunológica con la neumolisina nativa.

21. Una proteína PLY mutante aislada o conjugado inmunogénico para su uso según la reivindicación 20 en la que dicha infección bacteriana es una infección por Streptococcus, p. ej., infección por Streptococcus pneumoniae.

22. Un procedimiento de preparación de una composición inmunogénica, comprendiendo el procedimiento los pasos de:

proporcionar una proteína PLY mutante aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y conjugar la proteína mutante con un sacárido, oligosacárido, polisacárido, péptido, polipéptido o proteína.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en la que la proteína mutante se conjuga con un polisacárido de Streptococcus pneumoniae.